酵母高纯质粒小量快速提取试剂盒 ( 带 lyticase)

公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断！

商品属性：

产品名称	规格	货号
酵母高纯质粒小量快速提取试剂盒 ( 带 lyticase)	50 次	P-PR1018

 

保存条件：本产品收到后按照上面指示温度存放各成份，18 个月不影响使用效果。
产品介绍：
本试剂盒采用改进 SDS-碱裂解法裂解细胞并结合 lyticase 特异消化酵母细胞壁，能在 1 小时内从酵母培养液中分离出高纯度质粒 DNA。酵母收集后,加入破壁酶去除细胞壁后,然后碱裂法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低 PH 值状态下选择性地结合溶液中的质粒 DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高 PH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。
产品特点：
1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的质粒产量高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。
注意事项：
1.第一次使用时，将试剂盒所带的全部 RNase A 加入溶液 YP1（终浓度 100µg/ml）置
于 4℃保存。如果溶液 YP1 中 RNase A 失活，提取的质粒可能会有微量 RNA 残留，在溶液 YP1 中补加 RNase A 即可。
2.环境温度低时溶液YP2中 SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清,不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
3.为避免降低活性,方便运输，提供 Lyticase(2500U)为冻干粉状，收到后，可短暂离心后，加入 250µl 灭菌水溶解配制成 10U/µl，因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量分装冻存,－20℃保存。
4.溶液 YP3 和去蛋白液 PD 中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5.得到的质粒 DNA 可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260 值为 1 相当于大约 50µg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为 2 条或者多条 DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成,与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。
6. 用户需要自备 Sorbitol buffer( 1M 山梨醇，0.1M Na2EDTA，14 mMβ-巯基乙醇)。
配制方法：在 600 ml 去离子水里面溶解 182.2 克山梨醇，加入 200ml 0.5 M Na2EDTA(pH 8.0) ，不需要调节 PH 值，定容到 1L，4℃保存。临用前加 0.1%β-巯基乙醇(商品化的β-巯基乙醇摩尔浓度一般为 14M)。
7.菌体浓度检测一般 OD600 值为 1 的时候,酿酒酵母细胞是 1-2x107 cells/ml，由于菌种和分光度计不同即使同样细胞数量 OD 值变化也很大，以上仅供参考。
8.洗脱液 EB 不含有螯合剂 EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保批 pH 大于 7.5，pH 过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在－20℃。质粒 DNA 如果需要长期保存，可以用 TE 缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0），但是 EDTA 可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。
自备试剂：无水乙醇,Sorbitol buffer（1M 山梨醇，0.1M EDTA,14mM β-巯基乙醇）
操作步骤：
提示：
 第一次使用前请先在 15ml 漂洗液 WB 中加入 60ml 无水乙醇，充分混匀，加入后
请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
 将 RNase A 全部加入溶液 YP1 中，混匀，每次使用后置于 2-8℃保存。 要想得到更高的提取量，可将 YP3 溶液放在冰上预冷。
 吸取使用量的 Sorbitol buffer 加入 0.1%β-巯基乙醇，回复到室温备用。
1.向吸附柱 AC 中（吸附柱放入收集管中）加 500µl 的平衡液 BL，12,000rpm 离心 1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
2.取 1.5ml 酵母培养物(不超过 5×10
7 cells)，12,000rpm 离心 30 sec，尽可能的吸弃上清，收集酵母细胞。
3.加入 600µl Sorbitol buffer，轻柔吹打充分重悬细胞，加入 Lyticase 50U（5µl，10U/µl），充分颠倒混匀，37℃温育至少 30 min 消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。
4.12,000rpm 离心 1 min，尽可能吸弃上清，加入 250µl 溶液 YP1 重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。
5.加 250µl 的溶液 YP2，温和地上下翻转 4 -7 次使菌体充分裂解，室温放置 4min。
6.加 350µl 溶液 YP3，立即温和地上下翻转 4 -7 次,充分混匀时会出现白色絮状沉淀。冰上静置 3-5 min，12,000rpm 离心 5 min，小心取上清。
7.将上一步所得上清加入吸附柱 AC 中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm 离心 30-60sec，倒掉收集管中的废液。
8.加入 500µl 去蛋白液 PD，12,000rpm 离心 30-60 sec，弃废液。
9.加入 500µl 漂洗液 WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心 30-60 sec，弃掉废液。
10.重复步骤 9。
11.将吸附柱 AC 放回空收集管中，12,000rpm 离心 2 min，将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
12.取出吸附柱 AC，放入一个干净的离心管中，室温放置几分钟。
13.在吸附膜的中间部位加 50µl-100µl 洗脱缓冲液 EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置 2 min，12,000rpm 离心 1 min。如果需要较多量质粒，
可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心 1 min。（注意：若后续做测序，需使用 ddH2O 做洗脱液，并保证其 pH 值在 7.0-8.5 范围 内，pH 值低于 7.0 会降低洗脱效率。且 DNA 产物应保存在-20℃，以防 DNA 降解。）