pPIC9K Seamless Cloning Kit（线性化质粒）

产品编号： P-PR1230

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P-PR1230-20μl	20μl	¥1560.00	登录查看
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pPIC9K Seamless Cloning Kit（线性化质粒）	20 μl	P-PR1230

保存条件：-20℃保存
产品介绍：pPIC9K 为毕赤酵母表达载体，载体能够使用的毕赤酵母宿主菌是 KM71 和 GS115。 pPIC9 载体大小 9276 bp，是融合表达载体，利用 alpha 因子分泌信号肽，分泌表达蛋白基因。在毕赤酵母中利用 HIS4 进行筛选。在载体构建过程中，目的基因必须保证与信号肽的起始密码子的读码框一致。本产品提供pPIC9K 经EcoRⅠ酶切后的线性化载体，可用无缝克隆技术将单个或多个 DNA 片段组装到载体上。无缝克隆技术可在重组酶的作用下，只需一步反应，便可将片段克隆到任何载体中的任意位置，得到重组质粒。无缝克隆技术作为一种非常强大的克隆技术，具有快速、简便、高效、多片段组装和定向克隆等特点，用于单个 DNA 片段的克隆，多个 DNA 片段组装克隆以及多位点突变构建等实验目的。
产品特点：
1. pPIC9K 为毕赤酵母表达载体，载体能够使用的毕赤酵母宿主菌是 KM71 和 GS115。
2. pPIC9 载体利用 alpha 因子分泌信号肽，分泌表达蛋白基因。
3. 在毕赤酵母中利用 HIS4 进行筛选。
4. 无缝克隆技术只需要简单的 PCR 扩增就可以制备片段 DNA。
5. 可以克隆长片段和多片段 DNA。
操作步骤：
1. pPIC9K 线性化载体使用方法：
(1) pPIC9K 线性化载体当做克隆载体使用，可以在扩增 PCR 产物的
上游引物 5’端添加序列：GAGAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTC
下游引物 5’端添加序列：GCGAATTAATTCGCGGCCGC

通过无缝克隆连接到 pPIC9K 中。

(2) 测序引物
AOX1-F:GACTGGTTCCAATTGACAAGC
或 alpha-Factor-F:TACTATTGCCAGCATTGCTGC
AOX1-R:GCAAATGGCATTCTGACATCC
(3) pPIC9K 线性化载体为 EcoRⅠ酶切后的线性化载体。
2. 载体片段的重组连接
（1）在一个 0.2ml PCR 管中依次加入

（2）操作：轻轻混合，离心数秒。在 PCR 仪上 50℃保温 15 分钟。反应结束后，将离心管置于冰上，等待细菌转化。如暂时不转化细菌，可冻存于-20℃。
注意：
（1）载体用量一般在50-100ng较好。载体和片段的摩尔比为1:1 至1:3。片段小于200bp时，片段用量可增加到载体的 5 倍量。如果片段较多，可适当增大体系，如 20μl 。
（2）多片段连接，50℃反应时间不要超过 60 分钟。
3. 转化：具体操作以感受态细胞操作说明书为准。

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