公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断！
商品属性：
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产品名称 |
规格 |
货号 |
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pET-32a(+) Seamless Cloning Kit（线性化质粒） |
20 μl |
P-PR1228 |
保存条件：-20℃保存
产品介绍：pET-32a(+)载体为高水平的原核表达载体，在 N 端含有 TrxA(Trx-tag，硫氧还蛋白
标签)有利于蛋白的可溶性表达。pET-32a(+)在 N 端还含有 His-Tag, Thrombin（凝血酶）
酶切位点，S-Tag，Enterokinase(肠激酶)酶切位点，在 C 端具有 His-Tag。本产品提供
pET-32a(+)经 EcoRⅠ酶切后的线性化载体，可用无缝克隆技术将单个或多个 DNA 片段
组装到载体上。
无缝克隆技术可在重组酶的作用下，只需一步反应，便可将片段克隆到任何载体
中的任意位置，得到重组质粒。无缝克隆技术作为一种非常强大的克隆技术，具有快
速、简便、高效、多片段组装和定向克隆等特点，用于单个 DNA 片段的克隆，多个
DNA 片段组装克隆以及多位点突变构建等实验目的。
产品特点：
1. pET-32a(+) 载 体 为 原 核 表 达 载 体 ， 具 有 N-TrxA, N-His ， N-Thrombin, N-S ，N-Enterokinase 和 C-His。 2. pET-32a(+)经 EcoRⅠ酶切后的线性化载体，省时省力。
3. 无缝克隆技术只需要简单的 PCR 扩增就可以制备片段 DNA。
4. 可以克隆长片段和多片段 DNA。
5. 简单、快速、精确、定向克隆。
操作步骤：
1. pET-32a(+)线性化载体使用方法：
(1) pET-32a(+)线性化载体当做克隆载体使用，可以在扩增 PCR 产物的
上游引物 5’端添加序列：GTACCGACGACGACGACAAGGCCATG
下游引物 5’端添加序列：CTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG
通过无缝克隆连接到 pET-32a(+)中。
(2) 测序引物
PET-32A-SEQR: 5'-CTGGTTCTGGCCATATGCAC-3' T7t: 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3' (3) pET-32a(+)线性化载体为 EcoRⅠ酶切后的线性化载体。
2. 载体片段的重组连接
（1）在一个 0.2ml PCR 管中依次加入
（2）操作：轻轻混合，离心数秒。在 PCR 仪上 50℃保温 15 分钟。反应结束后，将离
心管置于冰上，等待细菌转化。 如暂时不转化细菌，可冻存于-20℃。
注意：
（1）载体用量一般在50-100ng较好。载体和片段的摩尔比为1:1 至1:3。片段小于200bp
时，片段用量可增加到载体的 5 倍量。如果片段较多，可适当增大体系，如 20μl 。
（2）多片段连接，50℃反应时间不要超过 60 分钟。
3.转化：具体操作以感受态细胞操作说明书为准
4.阳性克隆鉴定：（1）菌落 PCR 方法；（2）限制性酶切分析方法；（3）DNA 测序分析方法。
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