NADPH氧化酶（NAO）测试盒（比色法）

NADPH  氧 化 酶 （ NADPH oxidase） 活 性

 微板法  100 管/48 样>

注      意：正式测定前务必取  3 - 5  个预期差异较大的样本做预测定

产品简介：

NADPH 氧化酶（NAO）是一个典型的膜蛋白 ，催化  NADPH  氧化生成  NADP+ ， 并将电子传递给氧原子从而产生超氧阴离子。广泛存在于动物、植物和真菌中。该酶异常可 导致人慢性肉芽肿病（GCD） ，在植物中 ，该酶与其抗病性和各种胁迫有密切关系。

NADPH 氧化酶（NAO）将  NADPH 氧化为  NADP+的同时生成超氧阴离子(O2 .- )， 接着与显色剂反应生成水溶性的黄色物质。对照通过添加该酶的特异性抑制剂  DPI 排除背  景值。最终检测生成的有色物质在 450nm 处的吸光值，即可计算得出  NAO  酶活性大小。

试剂盒组分与配制：

所需的仪器和用品：
酶标仪、 96 孔板、低温台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰、蒸馏水。

①   若凝固可放置室温或  25℃水浴溶解。

NADPH 氧化酶（NAO）活性测定：
一、样本制备：
1、 组织样本 ：取约 0.1g 组织 ，加入  1mL 提取液 ，在 4ºC 或冰浴进行匀浆(或使用各 类常见匀浆器)。离心  10min（ 12,000rpm 4℃)  ,  取上清作为待测液。
【注】 ：若增加样本量 ，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为  1： 5~10  的比例进行 提取

2、 细菌/细胞样本 ：先收集细菌或细胞到离心管内 ，离心后弃上清；取约  500 万细菌或  细胞加入  1mL 提取液 ，超声波破碎细菌或细胞（冰浴 ，功率  200W ，超声  3s ，间隔 10s ，重复  30 次） ；离心  10min（ 12,000rpm 4℃)   ,  取上清 ，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104 ）：提取液（mL）为 500~1000：1  的 比例进行提取。

3、 液体样本 ：直接检测；若浑浊 ，离心后取上清检测。

二、实验准备：
1、 酶标仪预热  30min 以上 ，设定温度  37℃ ,  调节波长至  450nm。

2、 试剂三的配制：用前甩几下或离心使粉剂落入底部，分别加 0.55mL 蒸馏水溶解备用。 （用不完的试剂分装后-20℃保存 ，禁止反复冻融 ，三天内用完）
3、 所有试剂解冻至室温（25℃)  。

三、操作测定：
1、NADPH  氧 化 酶 （ NADPH oxidase） 活 性 在 96 孔板中依次加入：

【注】：若△A 的值在零附近 ，可以延长反应时间 T（如至 40min 或更长） ，则改变后的 反应时间 T 需代入公式重新计算。

结果计算：
2、 按样本蛋白浓度计算：
酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟在反应体系中使 450nm 处吸光值变化0.01 为一酶活单 位。
NAO(△OD450/min/mg prot) =ΔA÷(V1×Cpr) ÷0.01÷T
=250 ×ΔA÷Cpr

3、 按样本鲜重计算：
酶活定义 ：每克组织每分钟在反应体系中使 450nm 处吸光值变化 0.01 为一酶活单位。
NAO(△OD450/min/g 鲜重) =ΔA÷(W ×V1÷V) ÷0.01÷T
=250 ×ΔA÷W

4、 按细菌或细胞密度计算：
酶活定义：每  1 万个细菌或细胞每分钟在反应体系中使 450nm 处吸光值变化 0.01  为一 酶活单位。
NAO(△OD450/min /104 cell) =ΔA÷(500 ×V1÷V) ÷0.01÷T
=0.5 ×ΔA
V---加入提取液体积 ， 1mL；
V1---加入样本体积 ，0.02mL；
T---反应时间 ， 20min；
建议使用本公司的  BCA 蛋白含量检测试剂盒。
W---样本质量 ，g；
500---细胞或细菌总数 ，万；
Cpr---样本蛋白质浓度 ， mg/mL；