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海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)测试盒(比色法)

BH-9711152
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海藻糖-6-磷酸合成酶(Trehalose-6-phosphate- SynthaseTPS试剂盒说明书
分光光度法 50 /48
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
海藻糖是由两个葡萄糖分子以α,α-1-1 糖苷键连接而成的一种非还原双糖,广泛存
在于细菌、酵母菌、霉菌、食用菌、低等植物、昆虫、无脊椎动物和高等植物等多种有机体
中。海藻糖的非还原性决定了它对酸、碱、高温等的稳定性。另外,它本身具有很强的吸水
性,使它在生物体内具有抗脱水作用,在逆境条件下可通过识别外界刺激、产生和传递信号、
基因表达和代谢调节来保护植物免受不良环境的伤害。
植物体内主要以葡萄糖为底物合成海藻糖,该反应首先在海藻糖-6-磷酸合成酶
trehalose-6-phosphate synthaseTPS)的作用下,催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和 6-
磷酸葡萄糖反应生成中间产物6-磷酸海藻糖,再在海藻糖-6-磷酸磷酸酶 (trehalose
6-phosphate phosphataseTPP)的作用下去磷酸化,生成海藻糖。因此,测定TPS活性对于
研究植物逆境具有重要意义。
海藻糖-6-磷酸合成酶(Trehalose-6-phosphate- SynthaseTPS试剂盒测定原理:
TPS 催化 UDPG G6P 生成海藻糖-6-磷酸,同时产生 UDPUDP 在丙酮酸激酶与乳
酸脱氢酶作用下,氧化 NADH NAD+NADH 的下降速率与 UDP 含量成正比,通过 340nm
吸光度下降速率反映 TPS 活性。
需自备的仪器和用品:
分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前加入 10mL 试剂五溶解,用不完的试剂分装后-20℃
保存,禁止反复冻融;
试剂二:粉剂×2 瓶,-20℃保存;临用前每瓶加入 25mL 试剂五溶解;现配现用;
试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存;临用前加入 0.1mL 试剂五溶解,用不完的试剂分装后
-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂四:100μL×1 瓶,4℃避光保存;临用前低速离心,以防止试剂沾在管壁;
试剂五:液体 100mL×1 瓶,4℃保存;
海藻糖-6-磷酸合成酶(Trehalose-6-phosphate- SynthaseTPS试剂盒工作液的配制:临用前,先配置好 1 瓶试剂二和试剂三,然后在试剂二瓶中加入 25μL 试剂
三和 25μL 试剂四,充分混匀,现配现用。
样品测定的准备:
1、细菌或细胞的处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量
104 个):提取液体积(mL)为 500~10001 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL
提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3S,间隔 10S,重复
30 次);8000g4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、组织的处理:按照组织质量(
g):提取液体积(mL)15~10 的比例(建议称取约 0.1g
组织,加入 1mL 提取液),冰浴中匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤

 1、在 EP 管中加入如下试剂

试剂名称(μL

测定管

样本

150

试剂一

150

混匀, 30℃反应 20min 95℃水浴 2min 灭活, 冷却至室温。10000g 4℃离心 5min取上层 反应液待测。

2、工作液配制: 详见试剂的组成和配制中工作液的配制。

3、在 1mL 玻璃比色皿中加入如下试剂

 

反应液

100

工作液

900

混匀,测定 340nm  5min 后吸光值 A1  10min 后吸光值 A2 ΔA=A1-A2

TPS 活力计算:

1、按照蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

TPS 活力(nmol/min/mg prot)=ΔA×V 反总÷  ( ε×d×109÷V ×Cpr÷T×3=643×ΔA ÷Cpr

2、按样本鲜重计算

单位的定义:每 g 组织每分钟催化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

TPS 活力(nmol/min/g  鲜重)=ΔA×V 反总÷  ( ε×d×109÷W× V ÷V 样总) ÷T×3=643×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。TPS 活力(nmol/min/104  cell)=ΔA×V 反总÷  ( ε×d×109÷V ×细胞数量)÷T×3= 1.28×ΔAV  反总:反应体系总体积,1mLεNADH 摩尔消光系数, 6.22×103  L / mol /cmd:比色 皿光径, 1cmV 样:加入样本体积, 0.15 mLV 样总:加入提取液体积, 1 mLT:反应 时间, 5  min3,稀释倍数;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量;细胞数量, 500 万。

 

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