一提及细胞凋亡检测, 身旁从事科研的友人首要反应便是, “哎呀, 又要去进行流式操作了”。
但说实话，流式细胞术真的就是唯一答案吗？
起初我初次接触这个实验时, 如同多数人那般, 通过网络全面搜索一番, 随后依据经典protocol拼死钻研。那结果如何? 进行了三次, 数据依旧不尽如人意, 内心真是无比崩溃。
往后渐渐摸索出一点窍门来了，细胞凋亡检测这件事情, 它实际上是颇为“挑剔”方法的。
为啥我做的凋亡检测总是不稳定？
这个坑我真的踩过。
实话说, 里头的道理并不复杂, 细胞凋亡就是个处在动态变化中的过程, 从早期开始, 一直到晚期阶段, 细胞膜所发生的变化, DNA遭遇的断裂情况, 以及caspase被激活的状况, 每一个步骤所存在的“窗口期”都是不一样的。要是方法用错了, 那就如同于在错误的时间拍摄并得到了一张模糊不清的照片。
令人更加扎心的是, 你的细胞所处状态, 你的处理方式, 甚至你的离心转速, 都会直接对结果产生影响。在许多时候, 并非是实验方案存在问题, 而是细节之处没有仔细钻研直至完美到位。
Annexin V/PI双染有没有更好的替代？
这大约是众人所能熟知程度最高的了, 膜联蛋白V与磷脂酰丝氨酸相结合, 碘化丙啶对死细胞予以标记, 运用流式细胞术进行划分呈现出四个象限, 表面上看起来十分完美。
但我要说的是——这个方法的“坑”在于样本处理速度。
细胞自开始消化直至上机, 其间每一步骤皆在经历“衰老”过程, 倘若你操作动作迟缓, 原本早期凋亡的细胞便会转变为晚期凋亡以及坏死状态, 如此一来最终结果必将全然偏差, 故而我当下进行双染操作时, 均会预先备好流式管、buffer以及离心机, 自添加胰酶起始至上机完成, 将整个过程把控于一个连贯的操作流程之中。
另外还存在着这样一个诀窍, 那就是不要进行过度的洗涤, 有许多的protocol当中写着需要洗涤两三次，然而洗涤过于狠厉的话就会对细胞膜造成损伤, 进而导致出现假阳性的结果, 我当下一般仅仅只洗涤一次, 甚至有的时候都不洗涤, 只要直接加入binding buffer然后上机就可以了。
TUNEL法到底准不准？
检测DNA片段化的是TUNEL, 这是不是可以算作晚期凋亡的那种“确凿证据”呀?
不一定。
这事儿我碰到过好些回, TUNEL阳性率极为高, 然而从形态学上去看, 压根儿就不像是凋亡。随后查阅文献方才晓得, 坏死细胞的DNA同样会出现断裂, TUNEL根本没办法区分清楚。特别是对于组织切片而言, 坏死区域以及凋亡区域交织在一起, TUNEL的结果有时会对人产生误导。
因而我当下进行TUNEL操作, 必然会结合形态学观察, 像是查看核浓缩、凋亡小体。单单依据颜色深浅来判定结果, 极易出现差错。
除了流式和TUNEL，还有什么冷门好用的方法？
其实存在一种挺容易被遗漏而忽视的方法, 这个方法是什么呢, 它就是去检测caspase - 3活性。
这个指标算得上是凋亡的“关键紧要之事”了, 市面上存在专门制作的荧光底物试剂盒, 其操作相较于流式更为简便, 灵敏度同样很高。倘若去做western blot也可以, 然而在定量这方面却比不上试剂盒那般便利。
另外存在一种名为“彗星电泳”的办法, 看上去尤为酷炫, 它能够将DNA断裂的情形径直“描绘”出来, 凋亡细胞的DNA显露出来犹如彗星的尾巴, 正常细胞则恰似一个圆点, 此方法适宜用于单细胞水平的检测, 然而操作举措相对繁杂, 我始终未曾进行大规模的推广。
做细胞凋亡检测，最容易忽略的细节是什么？
是细胞密度。
我在这个问题上屡次吃亏。若是细胞被铺得过于紧密, 那么凋亡刺激所产生的效应就会被“群体效应”给遮掩住。要是铺得太过稀疏，又欠缺足够的细胞数量来进行检测。通常给出的建议是在铺板的时刻将汇合度把控在60%-70%, 如此这般在加药之后的24小时, 恰好能够观测到凋亡出现变化。
还有就是设置对照组的艺术。
千万不要仅仅只设置单一的一个阴性对照。处于理想的状况之下, 是需要去设置的有: 没有经过处理的对照组, 呈现阳性且诱导凋亡的组（就好比是用喜树碱来进行处理的那种情况）, 还有单染补偿组。只有这样, 等到数据出来才能够成功说明相关问题。
最后一点碎碎念
撰写如此之多, 并非是为了去炫耀自身所知晓的数量。但是却认为, 关于细胞凋亡检测这个事情, 真正来说并不是完全依据“凭借protocol进行操作”这般就足够了的。
每一回实验, 皆是一轮同细胞的交流。它向你表明何种情形下它会抉择死亡, 何种情形下它会奋力存活下去。于这个进程里, 你碰到的难题越多, 最终获取的答案就越真切。
倘若是你正着手进行这个实验, 发觉数据不尽如人意、难以复现之时, 切莫急着去怀疑自身。进而尝试更换一种方法, 调节一番参数, 放慢一下速度, 没准明日便能够得出漂亮的结果。
反正，我当年就是这么熬过来的。
