你有没有想过，细胞也是会“自杀”的？
绝非是在开玩笑，细胞绝非被动地等待着走向死亡, 它们有时会主动地做出选择来终结自身的生命, 如此这般具有程序化的情形就被称作细胞凋亡。这着实跟我们平常所提及的“坏死”简直决然不是一回事。坏死乃是遭受外力打击而死亡的, 凋亡是自身把自身全面分解得干干净净的。
于是乎, 问题便出现了, 你究竟凭借何种方式知晓, 一个细胞是自然地衰老继而走向死亡, 又或者是自行选择“终结”自身生命的呢?
这就牵扯到我们今天要聊的主题：细胞凋亡检测。
具体来讲, 就是给予你一个细胞样本, 你必须判定它是否正处于执行凋亡的程序里, 这件事情听起来颇具学术性, 然而对于从事实验的人员而言, 着实令人发愁。
为什么非得测细胞凋亡？
你可能觉得，死都死了，还测啥？
弄舛了。关于凋亡和坏死二者之间的差异, 于药物研发、疾病机制研究范畴内简直有着极大的不同。举例而言, 假设你正在试验一款抗癌药物, 你期望它能够将癌细胞予以消灭, 然而, 此时你期望它是借助凋亡路径来达成消灭癌细胞的目的, 还是期望它直接把癌细胞转化为碎片状从而消灭?
当然选取的是凋亡, 凋亡具备干净的特质, 凋亡拥有安静的特性, 凋亡不容易引发炎症。要是药物仅仅是将细胞弄成坏死状态, 那么其副作用会大得特别惊人。
所以, 进行凋亡检测, 并非仅仅是检测“细胞是否死亡”, 而是检测“它是以怎样的方式死亡的”。
那些让人头疼的检测方法
说实话，我第一次接触凋亡检测的时候，整个人是懵的。
那所谓的Annexin V与PI双染, 瞧瞧那TUNEL法, 再瞅瞅Caspase活性检测……这一个个名字说起来一个比一下更拗口, 做起来一项比一项更复杂。
最常用的：流式细胞术配Annexin V
这算得上是金标准了。其原理实际上颇为简单, 在凋亡早期的时候, 细胞膜之上的磷脂酰丝氨酸会翻转至外面, 而Annexin V恰似一个雷达, 专门用来识别此类信号。
但问题出现了: 您要有流式细胞仪吗? 那个东西价格不菲, 且操作的人员必须接受培训。好多小实验室根本不存在, 只能送出去检测, 一寄送就是一周, 等结果出示细胞都快要化为水了。
显微镜下的TUNEL法
这个朝着形态学方向更为偏向，染色之后于显微镜之下进行观察, 凋亡了的细胞的细胞核它会呈现出深色的状态, 仿佛是被涂抹上黑色那般。
优势在于具备直观性, 然而劣势则是, 它太过主观了。你于今日所统计得出的结果, 与明日统计得出的结果相比, 兴许会相差一半。并且它无法进行定量分析, 仅仅能够大致地瞧一瞧。
真的, 我见过有人拿着TUNEL染色的片子, 数了足足三个小时, 最终却发现染错了。
你有没有被抗体坑过？
提起Caspase-3检测，我真的有一肚子苦水。
Caspase - 3乃是在凋亡执行过程中扮演“刽子手”角色的存在, 从理论层面来讲, 对其活性展开检测属于最为直接之举。然而, 于实际操作的境遇之中, 抗体的质量显现出参差不齐的状况。存在一些抗体, 其特异性欠佳，染色之后呈现出一片明亮的态势, 以至于根本无法确切知晓究竟是凋亡信号还是背景噪音。
况且, 通过细胞裂解液来提取蛋白同样存在诸多问题。一旦手抖那么一下, 蛋白就会发生降解, 进而导致Caspase活性消失, 如此一来, 一整天的工作量就全都白费了。
我有一个朋友, 其目的在于测定一种药物的凋亡成效, 为此进行了七次实验的重复操作。直至第七次的时候, 才获取到了具备可看性的数据。他声称在那段时期当中, 只要看到Caspase这个词汇, 便会生出想要作呕的感觉。
新手最容易犯的两个错误
第一个：只测一种指标就下结论。
检查凋亡时, 最忌讳的便是仅仅依据一个数据, 就宣称说“这个药诱导了凋亡”。你起码得拥有两个以上独立的证据。比如说, Annexin V呈阳性了, 并且同时Caspase - 3也被激活了, 这样才算是可靠的。
第二个：忽略了时间点。
凋亡属于一个动态的进程, 早期阶段与晚期阶段的标志物全然不一样, 要是你于错误的时间节点进行取样, 极有可能什么都观察不到, 我曾目睹过一篇论文, 其作者测量的是24小时的凋亡率, 然而结果却是负的, 这是由于细胞早已全部死亡, 仅剩下一堆碎片, 根本没办法进行测量。
有没有更省心的办法？
说实话，现在的技术已经比十年前好太多了。
比如说, 存在部分试剂盒, 其已将Annexin V与PI配好, 仅需直接进行加样操作, 随后便能够上机参与检测。另外, 还有一些荧光探针, 在活细胞维持着相应状态的情况下, 便可实现对凋亡进程的实时观察, 此种观察方式并不需要对细胞实施固定操作, 并且不会给予样品破坏的影响。
但最关键的，还是你要理解你的实验体系。
检测方法不过是工具, 真正对结果质量起决定作用的, 是你是不是清楚自己想要的是什么, 是不是明白应该在何时去进行检测, 是不是晓得用哪种方法才最契合你的细胞类型。
不然再贵的试剂盒，也救不了你的数据。
写在最后
细胞凋亡检测这事儿，说难也难，说简单也简单。
这之所以难, 是由于它关联诸多细节, 一旦有一个环节出现问题, 数据便会报废。而它之所以简单, 是鉴于只要你领会了基本原理, 多多进行练习, 实际上也就不过是那几种方法。
要是你此刻正为一项凋亡检测实验而苦恼, 听我讲一句: 先暂且停下, 将实验设计重新细致审视一番。确认自己选准了时间要点、选对了衡量指标、运用了正确恰当的方法, 之后再着手去做。
浪费试剂不心疼，浪费时间和样本才真让人冒火。
反正我是被坑过好几次了，希望你比我运气好。
