诚实地讲, 实验室中的那台荧光定量PCR仪一开始呈现于眼前购置得以全新模样出现之际, 我对着那屏幕傻愣着, 呆呆的, 处于一种发愣的状态。
一系列曲线, 有着各样颜色, 以及那些 CT 值、扩增效率之类, 瞅着如同天书一般。最为糟糕的是, 隔壁师兄做出的数据十分漂亮, 而我一做出来的却是歪歪扭扭的 S 形, 老板看了之后径直叹气。
其实不光是我，很多人第一次接触这玩意儿都会懵。
什么是荧光定量PCR，简单说就是啥？
你先忘掉那些课本定义。
讲的是荧光定量PCR, 其实际上是普通PCR的进阶版本。普通PCR类似煮饺子, 你仅晓得锅里存在饺子, 却不晓得具体数量有多少。荧光定量PCR则不同, 是一边煮一边查看, 每有一个饺子出现便计数一个。
实时。定量。就这么回事。
反应管之中添加了荧光染料或者探针, 每一次实现DNA链的扩增, 便出现一个相应的荧光信号, 仪器持续进行记录活动, 最终为你描绘出一条曲线, 你凭借查看那条曲线, 就能够明确一开始存在多少模板。
CT值越小说它就越多吗？
对。
开始曲线急剧向上攀升的那个点位是CT值, 其专业称谓是“阈值循环数”。倘若你所拥有的样本里模板繁杂众多, 只需经过数次循环即可迅速上升, 如此一来该样本的CT值便会较小。反之, 要是样本里模板数量稀少, 那就需要长时间的运行才能察觉到信号, 此时的CT值便会偏大。
所以别搞反了。CT值小=含量多，CT值大=含量少。
有一回, 我选用标准品来实施梯度稀释操作, 按照10倍作为一个梯度的方式, 从100万拷贝一直稀释到10个拷贝。最终, CT值毫无差错地呈现出了3.3的差值, 就在那一瞬间, 我真切地产生了一种“我与仪器心灵相通”的错觉。
当然现在没这种感觉了，因为它经常闹脾气。
为什么我的扩增曲线歪歪扭扭？
这个太常见了。
假如曲线扭扭歪歪的, 那要尽快排查一下你的模板当中有无如蛋白质、酚残留物、乙醇等会妨碍聚合酶发挥作用的杂质。要是酶不能正常工作, 曲线又怎会达到理想状态呢?
再者便是引物设计, 引物设计倘若不佳, 特异性便会欠缺, 所扩增出的产物乱象丛生, 曲线也就自然而然显难看之势, 我仍记得首次自行设计引物, 自视甚高地弄了一对, 结果跑出来三条熔解峰, 老板瞅了一眼便道: “你这是在扩增整个基因组吧。”。
相对定量和绝对定量，选哪个？
这得看你要干嘛。
你要晓得具体存有若干个拷贝, 此即为绝对定量, 就像“这根管子里头存在一万两千个病毒颗粒”这般。于这个时候, 你得要有标准品, 得去制作标准曲线, 得精准至数字。
相对定量较为简便, 我只需要清楚A样本相较于B样本多几倍即可。比如说, 给药之后某个基因的表达量是给药之前的3.5倍。在此种情形下, 运用2的负ΔΔCT次方进行计算便可, 无需购置价钱昂贵的标准品。
大部分科研文章用的都是相对定量。省钱省事，老板满意。
内参基因该怎么选？
选内参这事吧，说难不难，说简单也容易翻车。
Housekeeping Gene要是理想的话, 就得在所有样本当中稳定地进行表达, GAPDH、Actin、18S rRNA、UBC这些乃是常用的选项, 然而问题在于, 于不同的组织以及不同的处理条件之下, 它们同样会发生变化。
有这样一个情况, 我有个朋友, 一直在从事脂肪组织的基因表达相关工作, 他所采用的是GAPDH作为内参来进行操作, 之后, 当把加药组跟对照组的结果相互做一对比, 就出现一个状况了, 经过相应药物处理的那一组里, GAPDH呈现出的表达量竟然翻了一倍。然后, 你能猜到后续发生了什么吗? 他最终所得到的那些基因表达差异, 全部都是虚假的。
后来换了18S rRNA做内参，数据才正常。
因此在开展实验之前, 最好是先去验证一下内参于你这个体系当中的稳定性, 不要进行想当然的行为。
为什么阴性对照也出了信号？
完了，这是污染。
荧光定量PCR里污染具有很大危害性。该测试灵敏度极高, 哪怕仅一个气溶胶颗粒无意中进入, 也会产生阳性信号。
我曾有过这般经历: 在那段时候进行病毒检测, 阴性对照始终存在信号。如此状况持续折腾了一个月, 最终查知是移液枪枪头吸附了气溶胶。随后更换了带有滤芯的枪头, 并重新配制了所有试剂, 这才总算使阴性结果得以压制。
自我那样之后, 我在进行荧光定量PCR操作时, 都会佩戴口罩, 开启超净台, 并且将操作区、模板加样区以及扩增区相互分开, 此后就再也未曾出现过任何问题了。
扩增效率怎么才算好？
想要实现的扩增效率为100%即每个循环DNA量翻倍, 然而真要实际达成处于90%至110%的范围就算可以了。
究竟该如何进行计算呢? 标准曲线斜率处于 -3.6至 -3.1这个范围之内时, 与之相对应的效率便处于90%至110%这个区间之中。要是你所计算得出的效率为80%或者120%, 那就表明体系存在问题了。有可能是存在抑制剂, 有可能是出现了引物二聚体, 也有可能是模板浓度核算出现了错误。
每次做实验的时候, 我都有着去跑一个标准品梯度的习惯, 目的是看看效率如何。要是效率出现不对的情况, 宁愿重新去做, 也不会得过且过。
数据怎么分析才不会被审稿人怼？
这事我踩过坑。
仪器跑完之后所出的CT值, 并非是能够直接拿来进行计算的。你需要首先去检查扩增曲线以及熔解曲线。看起来呈现出不正常状况的, 例如出现了非特异性扩增的情况, 要直接将其剔除掉。
接着在进行相对定量之际, 采用2的负ΔΔCT次方这一公式。不过需要留意的是, 此公式存在一个前提条件: 目标基因以及内参基因的扩增效率应当大致相近。倘若相差过多的情况, 那就需要运用Pfaffl法予以校正。
在最后阶段进行的是统计分析, 生物学重复所需要做的次数至少为3次, 技术重复同样不能少于3次, 绝不容许有偷懒行为发生。
那次, 我存有快速得出数据的想法, 只为了做出两次生物学重复, 认为具备明显差异便觉得没事情况了。然而, 审稿人直接要求我去补上实验, 导致拖延了三个月时间才得以发表。
荧光定量PCR能活用到什么程度
其实这玩意儿用途太广了。
不去讲基因表达分析了。病毒检测, 转基因成分鉴定, 微生物群落分析, SNP分型, miRNA检测, 拷贝数变异分析等, 只要是和核酸有联系的, 均可使用。
前些日子瞅见有人启用荧光定量PCR去测量水中某一种细菌的数额, 相较于传统的培养方法快了好多好多倍。另外还有进行食品溯源工作的, 借助它来判别牛肉到底是不是真正的牛肉。
拿科技来讲, 当你将其视作工具之时, 它便只是工具而已 , 而当你把它当作玩具之际, 它能够玩出各种各样令人意想不到的花样来。
写了这么多，其实就想说一件事：荧光定量PCR没那么玄乎。
需要你去针对原理展开清晰的透彻理解, 将步骤予以规范的设定, 随后进行多次实际的练习。要是曲线遭遇偏移不要慌乱, 当分析得出情况存在错误时不要着急, 按照顺序逐一进行详细的检查。
谁不是从被老板骂到能独立操作的呢。
不管怎样, 当下我瞅见那些色彩斑斓、形态各异的曲线时, 心里已然有了底, 清楚晓得哪些情形值得为之欣喜, 哪些状况需要重新去做, 如此说来便足够了。
