PCR扩增快试剂盒到底快在哪？别只看价格
我着实是服了, 明明实验周期也就那么多天, 时间比任何东西都金贵, 可偏偏PCR这一步还非得等半天, 一个扩增做完, 人就只能坐在机器边上发呆。
这说的不是你，还能是谁？
我从事分子实验工作, 在这几年里, 测序这一环节, 依靠PCR来开展, 克隆环节, 也借助PCR, 鉴定环节, 同样离不开PCR。早些年的时候, 觉得那些宣传“30分钟就能出结果”的说法特别能唬人, 心里想着, 怎么会比常规的速度还要快呢。
在后续实际去尝试使用了几款快速PCR扩增试剂盒之后, 这才领悟到, 速度快并非意味着毫无章法地快, 其关键之处在于, 相关的酶得到了优化处理, 并且buffer体系也发生了改变, 甚至就连热启动的那几个步骤都实现了精简化。
你去细致思考一下, 常规PCR在逐个循环逐个循环往下进行的时候, 退火这个环节以及延伸这个环节所需要的时间被拖得相当长, 当进行到40个循环的时候, 好家伙, 两个小时就这么没了。
这还是一场。
快速试剂盒到底改了啥？
实在讲, 最开始的时候我也是处于困惑茫然的状态。随后经过一番查找探究, 主要原因在于聚合酶的演变进程。部分工程酶的速度快得惊人, 其延伸速度提高了五六倍之多, 退火所需时间被压缩至几秒甚至更短。并且, 还有诸如快速解链技术, 以及在缓冲液中添加了一些能够促进反应的添加剂等因素, 如此一来, 整个流程就好似开启了作弊功能般。
不过呢, 我得讲句实在的话, 并非所有的样本都是适宜快速试剂盒的。存在这样的情况, 有的时候模板质量欠佳, 并且 GC 含量偏高, 还有复杂的模板, 即便如此快速试剂盒也有可能出现状况。
你到底该选啥？
这个问题我问过自己好多次。
市面上常见的, 存在那种宣称20分钟就能终结战斗的, 亦有25分钟、30分钟的情况, 实际上你要考量自身实验室里头的机器能否与之相符, 有些陈旧不堪的PCR仪, 其升降温的速度难以跟上节奏, 纵使快试剂盒亦是徒劳无功。
我曾经历过踩坑情况, 购买了价格较高的进口产品。然而, 却发现其退火温度窗口极其狭窄, 只要稍微出现偏离, 便无法扩出结果。尔后, 又尝试了几家国产的产品, 结果发现其中有些产品的配方调整比较人性化, 宽容度较高。虽然搭配普通taq酶不行, 但是搭配它们的专用mix, 稳定性以及速度都能够承受得住。
别只看价格，但也不能不看
这个圈子存在一种普遍毛病, 只要一提到快速试剂盒, 便会觉得其价格昂贵, 的确有些进口品牌单次反应的成本并不低, 然而国产的如今也颇具竞争力, 关键在于要看您所做实验的批次数量多少, 倘若批次量较大, 选用快速试剂盒能够节省时间, 节省出来的时间可以用来做更多实验, 如此折算下来或许反而更划算。
曾有一回我忙于赶项目, 要求在三天之内得出结果, 所依靠的便是快速试剂盒。常规情况下跑一轮PCR需要两个小时, 而快速的那种用时不到四十分钟, 一天能够跑七八轮。效率一下子就达到了最高限度, 数据量得以提升, 就连审稿人都找不到反驳的理由。
核心问题：它真的稳定吗？
这事我纠结过很久。
便捷式PCR扩增试剂盒, 实际上就是以些许牺牲扩增保真程度为代价来换取扩增速度。存在一些高保真酶能够被制作成快速版本, 然而的确有个别生产厂家在保真性能与速度之间未能达成良好平衡, 致使扩增出的条带数量众多, 非特异性扩增现象大量出现。
我的经验是，先测试，别上来就批量用。
用你平常惯用的模板, 去跑若干个梯度退火温度, 瞧瞧在哪一个温度之下最为干净。要是背景偏高, 那就表明体系还未达到足够优化的程度, 换另外一个牌子尝试一下。
有的快试剂盒添加了校正酶, 其保真度挺好, 适宜用来做克隆, 有的则单纯依靠速度占优, 适合开展检测型实验, 你必须清楚自己所需的是什么。
给新手的忠告
要是你才刚开始进入这一行, 绝对不要去盲目迷信“快就是好”这种说法。首先得去学习掌握跑常规PCR的方法, 弄明白其中那些参数各自所起到的作用是什么, 之后再去尝试挑战使用快速试剂盒。
不然你连条带是目的还是污染都分不清，时间省下来干嘛？
当前, 我手中持有三四个不同牌子的快速PCR扩增试剂盒, 会轮流使用它们, 依据样本以及目的来挑选。其中, 有的试剂盒适合长片段, 有的适合高GC, 还有的仅仅是单纯速度快, 是为了图省事。
说到底，实验这东西，没有万能的工具，只有不断试错的人。
你如果还在纠结选哪个，我可以告诉你一句话：看你的主战场。
有的是天天都得要出结果的那种情况, 那就选择买快的, 有的是偶尔才跑一跑的那种情况, 常规的就足够了, 千万不要被价格给牵着鼻子走, 得先去看实验需求。
毕竟时间就是命，实验人的命，更贵。
