养细胞这事儿，真的能气死人
我敢放话, 在实验室里经历了原代细胞培养过程的十个人当中, 会有九个人都曾失手致使培养瓶掉落——并非是存心所为，而是在“怎么又死掉啦”这样的刹那间由于手部失控而意外滑落了。
起初听闻小鼠原代细胞, 似乎觉得挺简单, 不就是从组织里分离出来然后养着。真正实际去操作时, 它可比你所想象的要娇气一万倍。今天早晨你才刚换的培养基, 到了下午它就给你脸色瞧, 呈现出漂浮的状态, 好似是一群心灰意冷的微小物体, 正准备集体去自杀。
我实实在在目睹过师姐去饲养那历经三天的肝细胞, 到了第四天清晨赶去查看时, 竟全都漂浮起来了。师姐伫立在超净台的前面处, 长时间处于沉默的状态, 最终吐出了这样一句话: “我渴望回到家中。”。
为什么小鼠原代细胞这么难搞？
不少人觉得, 只要依照protocol去做, 便不会有问题, 难道不是吗? 然而你去尝试一下, 当细胞分离之际消化所耗费的时间多了一分钟, 又或者离心的转速少许高了那么一丁点儿, 它们可不依不饶了。
那些永生化的细胞系, 不论怎样折腾都能够存活, 它们可不是这样, 原代细胞才刚刚从体内出来, 它们还携带着身体的记忆, 脆弱得如同刚出生的婴儿一般。
起初我着手养小鼠大脑皮层神经元之际, 连续报废了三批。第一批出现了污染状况, 第二批第二天就全都死亡了, 第三批——直至如今我都不愿对此加以回想, 原因在于我培养基温度没有预先加热妥当, 它们一同停止工作了。
那种挫败感，真的不是一般人能扛的。
你的手，就是它们的命运
讲真的, 从事养原代细胞这个事儿, 百分之六十是依赖技术, 百分之四十得靠玄学。然而要是你技术足够出色, 那么玄学的那一部分便能够不予考虑。
比如说, 我知晓一位老博后, 他从开展分离组织的操作, 到进行种植细胞的行为, 整个过程所历经的时长不超过四十分钟。他手部动作的速度快到让我心生怀疑, 他是不是背着别人偷偷去练习过钢琴。他所培育的细胞从来都不会死亡, 其状态好到仿佛自身能够发光发亮。
过后, 他跟我讲了一个秘密, 原代细胞最惧怕的并非营养不足, 而是“等待”。
一旦你稍作等待, 细胞便开启了凋亡程序。它们和你于淘宝购物时的情形不同, 是没法等的。自其从体内被取出的刹那之时起, 就已然开始着急起来, 你将它们越快地放置到适宜的培养环境当中, 它们便会愈发情愿存活下来。
培养基的秘密，没人跟你说
在市面上售卖培养基的那些, 都声称自身的配方极为优秀, 然而一旦你真正使用过后就会发觉, 它们是针对细胞系所设计的, 并非针对原代细胞。
原代细胞需要的东西太特别了。
有的所需的是特殊的生长因子, 有的所需的是基质胶, 有的甚至所需的是你为它配备一个“老朋友”, 比如说你在饲养小鼠肺成纤维细胞之际, 若不添加特定的细胞外基质成分, 它们根本就不肯贴壁。
最大的坑被我踩过的情形是这样的: 有个被称作“万能原代培养基”的物品我买了, 然而养何种就死何种。之后我才弄明白, 不存在万能这种情况。原代细胞凭借每种组织来源展开, 都存有自身独有的习性。
污染了怎么办？别慌
开展原代细胞的培养工作, 污染成为无从躲避难以逃脱的困境。特别是针对源自肠道组织以及皮肤组织当中所分离取得的细胞, 细菌与真菌几乎是必定出现无可避免的情形。
我存在一位师弟, 其从事养小鼠肠上皮细胞这一工作, 在每次进行操作的时候, 都需要添加双倍剂量的双抗, 然而最终的结果却是依旧出现了污染的情况。随后经过探寻发现, 他所使用的PBS自身原本就已经被污染了。
你说气不气人。
然而, 实际上存在部分小窍门能够大幅度削减污染比率, 举例而言, 于组织离体之后, 首先采用饱含高浓度抗生素的PBS多次进行冲洗, 进而再予以切碎, 另外, 手术器械务必单独予以处理, 切勿跟开展别的实验共同使用此操作。
这些细节，protocol上不会写，只有踩过坑的人才懂。
其实你离成功就差一步
很多人觉得原代细胞养不好，是自己能力不行。其实不是的。
多数情形下, 是你未曾寻觅到适配那种细胞类型的“配方”。小鼠原代细胞并非是一个统称, 它们当中的每一个都拥有自身的名字, 具备自身挑剔的口味。
像是神经元, 需要无血清培养基再加上B27, 肝细胞呢, 要添加地塞米松以及胰岛素, 心肌细胞则要加入BrDU去抑制成纤维细胞。倘若你将它们混合着使用, 它们就会以死亡来向你展示后果。
我见识过极为狠厉的一人, 为了妥善培育小鼠骨髓所产生的巨噬细胞, 自行配置了十几种存有各异浓度的M-CSF, 逐个去尝试, 最终好不容易试出了最为适宜的剂量。在他获取成功的那日, 于实验室里大声呼喊了一回, 致使隔壁实验室之人俱都认定他发疯了。
但那种快乐，真的只有经历过的人才懂。
写在最后，但很真诚
撰写这篇文章, 并非是妄图传授给你任何高深莫测的理论, 那些官方的protocol以及论文之中, 所阐述的内容比我要清晰许多。
我仅仅是想要表达, 要是你当下正遭受着小鼠原代细胞的困扰, 心里想着自己是不是不太适宜去做实验, 又或者对人生心生疑惑——千万别着急, 你并非是独自一人。
每个养过原代细胞的个体, 都历经了那一个阶段。那些看似养得良好的个体, 只是比你多踏了几个坑洼, 多尝试了几回, 多哭泣了几次。
有一种名为原代细胞的事物, 它的状态恰似生活的模样, 当你内心急切渴望时, 它却愈发不予以配合, 而当你放松自身状态, 平稳心绪, 按部就班地进行操作, 它反倒会给予你意想不到的惊喜。
别放弃，细胞总有听话的那一天。
