其实我第一次接触荧光PCR的时候，心里也犯嘀咕。
这东西到底靠不靠谱？为啥现在到处都在用？
而后做的次数多了起来, 渐渐地也就明白了。今日不去讲那些迂回曲折、来回往复的专业术语, 单单谈论些许实实在在的内容。
荧光PCR检测，原理其实没那么玄乎
很多人一听“荧光PCR”，就觉得是啥高精尖的东西。
不是的。
如此这般来讲, 它实际上就是为目标分子安装了一个“追踪器”。每一次进行扩增的时候, 一旦扩增出一份, 荧光便会亮上一分。当机器进行读取操作时，相应的数字就会呈现出来。
类似于你在数钱之际, 每数取一张便会“啪”地一下弹出手指。而荧光即是那弹出手指所发出的声响。
只不过它弹得特别快，特别准。
当我自己刚开始学习之际, 前半部分全然处于困惑状态。诸如曲线, 阈值, 扩增效率呀等等。然而, 当你亲自动手完成了一批样品的操作, 目睹那些排列整齐的S型曲线呈现出来之时, 那种感受, 仅用一个字来形容: 爽。
为什么现在不用传统PCR了？
传统PCR也有它的好，但真的太麻烦了。
完成跑步之后, 还得去做电泳, 要进行制胶, 要进行加样, 要进行拍照, 等这一系列操作全部完成, 一共需要耗费三个小时。并且, 你仅仅能够凭借眼睛去查看是否存在条带, 至于究竟有多少条, 只能依靠眼睛去估算。
荧光PCR直接在机器里就看见了。
过程为全封闭, 相比较污染风险小很多。你去思考一下, 开启盖子去进行跑电泳, 致使气溶胶四处飘散, 如此一来假阳性便出现了。
有一回, 实验室里的师兄做传统PCR, 手抖了那么一下, 加样孔全都飘起来了, 我现在还记得这事呢, 当时那个下午, 他独自一人对着电泳仪出现的惨淡条带发愣。
荧光PCR就稳多了。你只管把管子放进去，剩下的交给机器。
荧光PCR检测灵敏度真的那么高吗？
是真的高。
但这话得说清楚。高到什么程度？理论上能检测到几个拷贝。
但那是理想状态。
要切实去做的时候, 影响的相关因素实在是过多啦 , RNA提取那赖以关键的质量 , 引物运用的设计 , 酶所包含的种类 , 反应所构建的整个体系 , 不论其中哪一个环节出现了问题 , 灵敏度便会径直降了下来。
许许多多的坑我都踩过, 曾经有一回做了几十个试样, 然而全都是呈现阴性的, 经过长时间仔细排查, 才发明确实是提取试剂盒过期造成的。
故而呀, 灵敏度具备较高程度乃是一件值得褒扬之事, 然而其前提条件在于你务必将每一个环节均妥善完成，不然的话, 后续纵有再好的仪器也无法对你施以援手。
影响荧光PCR结果的因素有哪些
说到这个，我都能写本书了（当然不是真的写）。
排在首位的是样品质量, 组织未曾充分研磨, 细胞裂解并不彻底, 后续一切皆为徒劳。
再一个便是引物探针, 其设计欠佳, 致使非特异性扩增众多, 瞧瞧那扩增曲线, 歪歪扭扭, 仿若喝醉了酒一般。
第三个属于反应条件, 退火温度倘若高了或者低了, 循环数若是多了或者少了, 均会产生影响。
还有一个特别容易被忽视的——仪器校准。
我曾见过有人使用了长达三年之久的荧光PCR仪, 却向来都未曾做过校准, 结果所呈现出来的Ct值偏离了整整2个循环, 故而所有的数据都完全废掉了。
所以定期维护校准，真的不是走形式。
荧光PCR检测的常见误区
第一个误区：Ct值越低，样品浓度越高。
从理论层面来讲是如此这般 , 然而其前提条件乃扩增效率一致。要是效率彼此存在差异 , 那么 Ct 值便不能够直接做比较。
第二个误区：阴性对照没问题，结果就肯定可靠。
仅阴性对照未起峰, 仅能表明不存在污染情况。然而, 阳性对照是否起峰? 内标是否存在问题? 这些均是有待查看的。
第三个误区：同一个样品重复三次，结果必须一模一样。
可重复性良好的前置要件之时操作保持一致, 然你以手动方式进行加样呢, 绝难每次都精准无误至同一纳升程度, 故而准许存在一定程度的波动范围, 此乃必然情形, 是也。
但波动范围得有标准，不然就是瞎做。
荧光PCR实验中的那些坑
说几个我踩过的。
坑一：气泡。
完成加样操作后, 没有留意查看, 发现管子当中存在一个气泡, 结果导致整条曲线都处于抖动状态, 之后养成一个习惯, 每一次加完样均要求进行一次离心操作。
坑二：荧光淬灭。
需注意, 管子不要过长时间置身于强光的照耀之下。特别是那种加了探针元件的体系, 一旦有光线进行照射, 荧光就会消失不见。
坑三：反复冻融。
已然使用的试剂切勿再放回去, 因为经过反复冻融的酶会失去活性。我向来都是将其分装成较小的份数, 每使用一管便丢弃那一管。
坑四：引物二聚体。
存在这样一个状况, 那就是这般的最为让人恼烦。引物自行开展配对, 然而所显现出来的信号相比目标来讲显得更强。解决的办法便是进行新一轮的引物设计, 要不就是对热循环条件予以优化。
荧光PCR结果怎么解读才专业
首先看扩增曲线。
用于参照的曲线理应呈现为 S 型, 存在着指数变化的阶段、趋于平稳的阶段。要是曲线呈现出水平状态, 那就表明未曾实现扩增。要是曲线呈现出歪扭不直的形态, 那就存在有着被沾染或者并非特定属性的扩增的可能性。
然后看熔解曲线。
多峰就说明有非特异性产物。单峰才是干净的。
再看内标。
如果内标处于正常状态, 那就表明提取以及扩增不存在问题。要是内标不存在信号, 那么要么是样品之中存在抑制物, 要么是出现了操作失误。
最后看Ct值。
在同一批次当中进行比较, 倘若Ct值的差异处于1以内, 那么便算是正常的情况。要是差异大于2, 那就需要去思考是不是存在操作方面的问题了。
荧光PCR检测的未来会怎样
我感觉会越来越快，越来越小。
如今, 已然存在着那般具备微流控特性的荧光PCR, 只要插上电源便能够投入使用, 借助此该设备, 半个小时即可得出相应的结果。
再者还有数字PCR, 它直接将样品划分成几万个微滴, 使得每个微滴都能独立进行扩增, 其灵敏度更为高些, 定量也更加准确。
但不管技术怎么变，核心原理还是那套。荧光信号追踪扩增过程。
所以基础打好了，后面学什么都快。
写到这里，我想说一句。
荧光PCR此项技术, 切实改变了诸多事物, 它使我们目睹了往昔无法看见的微小信号, 使得那些沉默寂然的分子具备了发声的能力。
但技术终究是工具，真正重要的，是使用它的人。
你于做实验之际展现出的专注神态, 你在排查问题之时所流露的耐心态度, 以及你针对每一个数据所抱持的敬畏之情, 就是这些, 才是对于结果好坏起着决定作用的本质要素, 这一点是不容置疑的。
所以，别怕犯错。每一个坑都是学费，踩过了，你就比别人更懂。
