前几天我在实验室盯着一块孵育完的ELISA板发呆。
板子之上, 颜色呈现出深浅并不一致的状况, 存在着一些孔, 其模样好似浸泡过蓝墨水那般, 然而又有一些孔, 显得清汤寡水一般。紧挨一旁的师弟靠近过来提出询问道: “这样子的颜色究竟是怎样使之发生变化而呈现出来的呢? ”我朝着板子角落之处所放置的试剂瓶指了一下说道: “完全是依靠那个东西——酶标抗体。”。
要说这事儿的话, 是挺玄乎的存在。你思索思索, 抗体它自身根本就是个蛋白质, 其尺寸小到肉眼完全没办法看见的程度, 为啥它可以告知我血清里边有没有某一个病毒抗体这情况? 凭借的就是那个挂在上面的酶。
说穿了，酶标记抗体就是个“信号放大器”。
什么是酶标记抗体？核心就三个字
挂灯笼。
对于一个具有特异识别能力的抗体分子, 你去想象一下, 它如同一把钥匙一般, 能够精准地找到与之对应的锁, 这个锁就是抗原。然而, 这一把钥匙和另一把钥匙之间存在的差别, 你要怎样去区分? 毕竟肉眼是根本看不见的。
于是乎, 科学家想出了一个办法, 给这把钥匙挂上一个灯笼, 而这个当作灯笼的东西便是“酶”。
酶为什么能当灯笼？
因为它会搞化学反应。
辣根过氧化物酶, 此乃极为常用的灯笼, 你为其添加些底物, 诸如TMB, 它便能够将透明的液体转变为蓝色, 蓝色的深浅程度与酶的数量呈现正比关系, 酶的数量越多, 颜色越发深, 酶的数量越少, 颜色愈发浅。
所以检测的本质就变成了：看谁的颜色变得快、变得深。
但这里有个坑
诸多才开始接触ELISA的人极易犯下一个差错, 那便是会认为颜色越是深沉, 便意味着样品里头的目标蛋白数量越多。从理论层面而言这并无差错, 然而就实际操作方面来讲, 你所添加的酶标抗体的量, 以及孵育的时长, 还有洗涤是否彻底, 其中每一项都能够将你害得对人生充满怀疑。
曾经有一回我洗板时偷懒, 少洗了两遍, 结果空白孔全都蓝得发紫, 就在那一刻我明白了, 酶标记抗体的工作, 一部分依赖酶的反应速度得到实现, 另一部分借助操作者的手稳得以达成。
酶标抗体到底绑在哪？
这是个技术活。
有一种结构呈Y字形的物质叫抗体, 有一种要挂在这个呈Y字形结构物质的“尾巴”上的东西是酶, 这个“尾巴”也就是Fc段, 酶不能挂在识别区, 也就是Fab段, 不然抗体就认不出目标了, 酶的挂法有两种, 一种是采用化学方法将酶和抗体直接连接在一起, 另一种是用生物素 - 亲和素当作桥梁, 后面这种方法信号更强, 不过步骤也更多。
有个小细节容易被忽略
酶的活性和温度关系极大。
酶标抗体所惧怕的是什么呢? 惧怕高温。一旦温度超过了37℃, 它的能力就会大幅降低。所以在整个操作过程当中都需要留意冰浴以及低温保存。另外它还惧怕反复冻融, 每冻融一次就会有一批酶死亡, 信号也就会减弱一些。
为什么说酶标记抗体是免疫检测的“心脏”？
因为没它，你根本看不到抗原在哪里。
将目标蛋白摸不着、看不见、闻不到, 然而借助酶标抗体, 它会把“有没有”的问题, 转化成“蓝不蓝”的问题, 人眼对分辨颜色差别最为擅长, 并且颜色能够被酶标仪精准读取。
我还见过一种更野的用法
有人把酶标抗体用在组织切片上——免疫组化。
往切片之上添加酶标抗体, 随后再加入底物, 如此一来目标蛋白所处位置便会呈现显色现象。你想要查看的那个细胞核之中究竟是否存在某一种蛋白, 直接借助显微镜便能够看到。那种感受, 仿若于黑夜之际运用夜视仪去观看事物。
有个问题值得想想
酶标抗体这么牛，那它有没有缺点？
的确是有的。最为突出的问题在于——酶自身极有可能会遭受样品当中的内源性物质的干扰。举例而言, 某些组织样本自身携带着过氧化物酶, 倘若你运用辣根过氧化物酶进行标记, 如此一来便会生成背景噪音。解决的方式是采用另外一种酶——碱性磷酸酶, 又或者添加阻断液。
另外存在一个令人头疼的问题, 那就是酶标抗体的批次之间有差异, 不同的批次当中, 酶的活性并非完全相同, 所以每一次更换新的批次时都需要再次去做标准曲线。
说点更实在的
如果你刚开始做ELISA，买酶标抗体的时候记住三件事：
查询明白对方所采用的用以标记的酶究竟是什么。辣根所具备的过氧化物酶, 属于最为常被使用的, 然而碱性所拥有的磷酸酶, 于某些体系当中, 具备着更为稳定的特性。
查询稀释的比例, 部分厂家所生产的酶标抗体, 其浓度偏高 , 能够进行上万倍的稀释, 节省试剂以至于内心欢喜到极致。
留意清楚保存的条件, 有的酶标抗体冻干粉具备能够存放好几年的特性, 然而溶解之后就仅仅能够存放几周, 若买回来的时候没有留意看清楚说明, 那纯粹是在给自己制造麻烦。
最后说一个让我印象挺深的事
有一回帮师姐做双抗夹心ELISA, 到了最后显色的阶段, 标准曲线的那些点, 差不多极为精确地落在了一条直线之上。那种感受该怎么去表述呢, 就好似你调试好了显微镜的焦距之后, 世界猛地一下子变得明晰起来了。
使模糊转变为清晰的那个东西便是酶标记抗体, 它协助你将无法看见的生物分子, 转化为能够看见颜色的形态, 进而达成清晰呈现的效果。
所以, 一直到最后, 它实际上就是一个翻译官, 这个翻译官的作用是, 把生物所使用的语言, 翻译成能够让人类眼睛看得懂的颜色。
