哎唷, 提及荧光标记抗体呀, 好多人的首个反应便是“挑价格比较高的去买, 必然不会出错”。
然后呢？
然后呢, 钱财花费了许多, 然而, 实验的最终结果却是糟糕透顶, 简直一塌糊涂。在进行洗脱非特异性染色这个操作之时, 内心焦急到甚至恨不得将自己的脑子也一同清洗一番。
我懂你。
要说这东西, 实际上就是件工具。而工具是否好用, 并非取决于价格高低, 而是在于你对它是否了解。
荧光标记抗体到底是个什么东西
你把它想象成一个小火箭。
抗体作为弹头物件, 会专门去搜寻你所要检测的那个蛋白, 其尾部绑着一个荧光灯, 一旦荧光灯发亮, 你便能够看见寻觅的目标了。
就这么简单。
存在有这样一个问题即是, 倘若这火箭毫无目的胡乱飞行该如何是好, 要是荧光灯的亮度过于黑暗又该如何去改善；要是火箭在飞行进程当中突然掉落下来那又该如何应对?
所以你得挑。
为什么同一种抗体，有的贵到离谱有的便宜到让人害怕
这个问题我琢磨了好久。
而后, 有个从事抗体制作方面工作的友人讲了句实在话, 那便是, 存在一些公司, 它们只是把取自兔子的血清进行一番纯化处理, 而后随意标记上荧光就拿去售卖。凭这个, 你能期望它拥有怎样的特异性呢? 它自身连自己要去往哪里都不清楚。
不错的抗体, 自免疫原设计起始便执着钻研, 抗原表位挑选哪一位置, 免疫动物选用哪一种, 纯化进行几轮, 荧光染料与抗体的比例怎样调配, 每一步皆关乎资金。
但也不是说贵的就一定好。
有些知名品牌的抗体, 其价格溢价全都体现在品牌方面了。致使你花费高昂价钱购置回来的, 极有可能与隔壁实验室购买的中等价位的抗体并无什么差异之处。
荧光颜色怎么选，才不会被仪器坑
这事儿我吃过亏。
所购之物乃是具备远红外特性的荧光抗体, 将其带回之后, 放置于流式细胞仪之上进行操作, 却惊觉此通道根本未曾装备那款激光器呢。
你说我傻不傻。
找寻荧光之色的首要准则为: 瞧瞧你手头的仪器能够检测何种颜色。并非是你个人期望使用的颜色, 而是你老板购置的仪器所能检测的颜色。
第二原则：看你的样本背景。
组织样本自身存在着自发荧光这一情况, 你于绿色的通道进行测量时, 样本自身在那个地方发出光亮, 如此一来你的信号就被淹没了, 换成红色的或者远红外的通道, 背景瞬间就变得干净了。
保存条件到底有多重要
这东西娇气得很。
荧光染料怕光，怕热，怕反复冻融。
你要是把它往冰箱里一丢, 要是想起来时便拿出来利用, 要是想不起来那就搁置着, 过上两个月再次取出来, 荧光强度起码会下降一半。
我有一位同事, 其行为更为离谱, 他将荧光标记抗体放置于可达到零下二十摄氏度的普通冰箱里, 每一天, 冰箱门被开关达八百次之多, 抗体就在此情形下反复遭受冻融。而当使用该抗体时, 他还满腹牢骚地声称这个抗体不行, 连荧光都无法看见。
我说哥，你把抗体折腾成这样，它没死就算对得起你了。
应当采取的正确方式是: 进行分装, 将其分明为一小管一小管的状态, 在使用之时选取一管, 而其余的部分保持原状不用使之变动。
避免光线照射。自从从冰箱取出直至用完, 若能够做到遮光便尽量遮光而行。用锡纸进行包裹一番, 并不会危及人的生命安全。
稀释比例怎么摸出来
说明书上写的1:200，你试试行不行？
大概率不行。
先说那说明书里所提及的浓度, 乃是处于理想状态之下的。你采用的样本固定方式存在差异, 抗原修复方式也不一样, 甚至于你所使用的封片剂都不相同, 如此一来, 最佳稀释比例皆是不一样的。
怎么摸？
以不同比例进行梯度稀释, 比例分别为1:100、1:200、1:400、1:800, 对这些不同比例的稀释情况各自开展尝试, 去观察究竟是哪一个浓度能够达成背景洁净、信号足够明亮的效果。
别嫌麻烦。这一步花的时间，后面能给你省十倍的时间。
为什么做完实验，背景比目标还亮
第一次做免疫荧光的，十个有八个会被背景染色搞崩溃。
可能的原因是, 存在封闭不够的情况, 你所使用的封闭液与你的样本并不匹配, 或者你的二抗和样本里的内源性IgG发生了结合, 再或者你的荧光标记抗体自身存在聚集现象。
做个对照。
搞一个没加一抗的对照, 弄一个用同型对照的对照, 瞅一瞅背景究竟是从哪里冒出来的, 晓得来源之后, 才能够把问题给解决掉。
荧光会淬灭，怎么办
荧光淬灭是物理定律，你没办法完全避免。
但你可以延缓。
没有抗淬灭封片剂是不行的, 千万别在这方面省钱, 要是省了封片剂, 当你拍完第一张图后, 那么第二张图所呈现出的荧光就会减少一半哟。
还有, 当进行拍照操作之时, 光线不宜过强。你出于想要看得更为清晰这种目的, 将激发光调节至最大程度, 然而荧光仅仅一分钟便消失无踪了。
温柔一点。
选荧光标记抗体，最重要的是什么
是明确你的需求。
确定是做定性的, 还是做定量的? 是去看定位的情况, 还是去观察那个表达量? 所采用的样本究竟是什么? 所使用的仪器到底能够对什么进行测量?
把这些想清楚了，再去选。
千万别瞧见他人用啥你就跟用啥, 人家的实验条件跟你的并不相同, 人家的样本跟你的同样不一样。
你自己的实验，得你自己负责。
有着荧光标记的抗体属于一种工具, 工具的好坏与否, 取决于使用者是否会运用, 倘若会运用, 即便价格低廉的也能够产生良好的结果, 若不会运用, 无论花费多少钱都将是徒劳无功的。
好了，说完了。
去把你的实验做好吧。
