实话说来, 头一回进行Western Blot之际, 我的整个人状态都是处于懵然的状态。
瞅见那一堆瓶瓶罐罐, 有什么IgG, 有什么Fab片段, 还有各类宿主来源, 脑子简直如同是浆糊一般。就在那时我心里琢磨, 这东西究竟该怎么去挑选呀? 难道是越昂贵就越好吗?
并不是。
确实, 千万别被那些听起来高端大气上档次的名字给唬住。好多刚入门的朋友, 也包括当年的我自己, 最容易犯的一个错便是盲目地去追求高价格。认为贵的就肯定是好的, 肯定能跑出条带且带形漂亮。然而结果如何? 钱花出去了, 实验却失败了, 条带依旧糊得就跟一团马赛克似的。
心累。
其实，“一抗”这东西，核心就两点：特异性，和亲和力。
特异性体现于何种程度, 即它是否能够精确无误地寻觅到你所试图找寻的那个蛋白, 并且不会与其他形形色色的杂乱之物相互混杂在一起。亲和力所关乎的要点在于, 它抓取目标的力度究竟紧还是不紧。
这两个指标，往往在说明书上写得云里雾里。这时候，怎么办？
看文献。
对, 没错, 就是要去搜索那些从事着跟你一模一样课题研究的、被称作大牛的人们, 他们使用的究竟是何种牌子, 又是哪样的货号。这可不是所谓的迷信权威呀, 这实际上是站在巨人的肩膀之上从而达到省力的目的。要是在一篇具有较高分数的文章当中使用了某一款抗体, 并且其重复性同样非常之好, 那么你大概是不会遭遇失败的。
当然，也有例外。
偶尔, 相同的抗体, 于不一样的实验室, 甚至是身处不同的操作人之手, 其结果大相径庭, 这般状况着实极易扰乱人的心态, 令人烦闷。
为什么呢？
因为样本处理的不同。
所配的裂解液存在错误, 温度未能精准控制, 转膜时间出现了几分钟的偏差……诸如此类情况, 均存在让抗体无法顺利结合, 或者致使非特异性结合过于强烈的可能性。因而, 当遭遇问题时, 切莫立刻归咎于抗体质量欠佳, 应当首先审视自身操作环节是否存在疏漏之处。
这里有个小Tips，分享给大家。
要是你察觉到背景格外高, 尽是墨黑的一片, 别赶忙去尝试增加二抗稀释倍数, 或者降低一抗的浓度嗯。有时, 乃是封闭液没弄好, 才成为罪魁祸首的。牛血清白蛋白（BSA）以及脱脂奶粉, 究竟该选用哪一个?
那要看, 你所检测的蛋白, 究竟是不是磷酸化蛋白，倘若它是, 那就一定不要使用奶粉, 因为奶粉之中含有酪蛋白, 这会对信号造成干扰, 在这种情况下, BSA便成了你的救星。
反过来，如果不是磷酸化，奶粉往往封闭效果更好，便宜又高效。
省钱嘛，谁不喜欢？
再说说种属。
就是会容易弄混淆, 宿主是小鼠的情况下, 那你所欲检测的样本难道必然得是小鼠的吗, 并非一定是这样的, 是有其他情况的。
要是抗体是针对人源蛋白去进行设计打造的情形之时, 哪怕那您所提取的蛋白是从小鼠组织当中而来的, 只要其序列保守性质较为高的话, 它依旧是可以识别出来的。最为关键的要点在于要看表位序列的相似程度如何。
对于这一步, 提议前往NCBI那儿去比对一下氨基酸序列。虽说会麻烦那么一点儿, 不过, 比起盲目地去试错那可是要强出许多！
还有，单克隆和多克隆的区别。
具备特异性高、批次间差异小从而适合定量特点的是单克隆抗体, 灵敏度高、耐受突变能力强进而适合检测低丰度蛋白的是多克隆抗体。
没有绝对的好坏，只有适不适合。
你需要依据你所进行的实验目标来抉择, 要是你仅仅是想要瞧瞧一个大致的情况, 去确认蛋白质有没有进行表达，那么多克隆或许会给你带来更多的惊喜, 要是你打算做精准准确的定量分析情况, 單克隆就显得更为把握了。
别嫌麻烦，买之前多问一句客服，多查一条资料。
真的，能省下一大半的焦虑。
我想说的是，做科研就是不断试错的过程。
一抗只是工具，不是神药。
它没办法确保于你而言的每一次实验均能达成成功的事态, 但是它能够助力你去排除诸多并非必要的干扰情况。
你已然拿到一张漂亮WB图, 条带清晰, 背景干净, 就在那一刻, 成就感产生了, 这是任何事物都无法用来换取的。
那种快乐，真的，很上头。
所以，别怕失败。
哪怕条带跑歪了，哪怕背景脏得像地图，那也是过程的一部分。
整理好思路，优化好条件，下一次，一定会更好。
毕竟，我们都是在坑里爬出来的。
共勉吧。
