在生命科学的微观范畴之内, 小鼠骨髓由来的巨噬细胞, 也就是BMDMs, 是针对免疫反应、炎症机制以及细胞信号通路予以探秘的绝好模型。它跟由单核细胞分化而成的巨噬细胞存在差异, BMDMs留存了更为强劲的初始品性, 能够更为真切地仿造体内情形下的免疫回应。对于众多科研工作者来讲, 把控其分离、培育以及鉴定的整个步骤, 是开启高质量基础研究的根基。搞明白这一细胞生物学行为, 不但能够助力优化实验方案, 而且还能提高数据可重复性与科学性, 进而在繁杂病历生理研究里头占据主动地位。
如何高效分离小鼠骨髓巨噬细胞
骨髓前体细胞要力图获取纯净的, 这是于分离过程来讲颇为核心的, 一般会选用出生之后6至8周的小鼠, 借助脱臼法实施安乐死之后, 凭借无菌技术把股骨以及胫骨予以剥离, 使用注射器抽取PBS对骨髓腔实施冲洗, 一直到骨骼于冲洗之后变白, 这一步对于后续细胞的纯度起着决定性作用, 冲洗液要经由离心去收集沉淀, 并且通过红细胞裂解液施加处理来将杂质给去除掉, 关键之处在于动作得轻柔, 要防止剧烈吹打来致使细胞出现机械性损伤, 与此同时要把控好离心转速, 以保证细胞完整性不会受到影响。
待获取单细胞悬液后, 把它转至含有GM - CSF的培养基里开展诱导分化。GM - CSF乃是维持巨噬细胞存活以及增殖的关键因子, 其浓度必须精确地配制。把细胞接种到经过处理的培养皿之中, 放置于37℃、5% CO2的培养箱内静置着培养。在最初的那几天时间里, 细胞会贴壁并且渐渐融合, 这个时候应当避免频繁地移动培养皿, 防止干扰细胞正常的附着以及生长。定期去更换含有因子的新鲜培养基, 能够给细胞提供持续不断的营养支持, 推动其朝着成熟巨噬细胞转变。
如何鉴定小鼠骨髓巨噬细胞的状态
最直观的初步鉴定手段乃是形态学观察。成功的BMDMs培养物 , 应以呈现不规则的多边形或者梭形为表现 , 胞质丰富并且含有数量很多的空泡 , 部分细胞有可能伸出伪足。在显微镜之下 , 能够看见细胞核偏位 , 染色质算是较为疏松的。要是发现存在大量的悬浮死细胞或者细菌污染迹象 , 那么就需要立刻对操作环节展开排查。除此之外 , 细胞贴壁率也是用以衡量健康状况的关键指标 , 高贴壁率通常表明细胞活力处于良好状态 , 适合后续进行功能实验。
对细胞身份予以确认的金标准是流式细胞术, 借助检测表面标志物CD11b以及F4/80的表达水平, 能够精准区分巨噬细胞和其他免疫细胞, 阳性率越高表明分化特异性越好, 如果部分研究包含MHC-II类分子, 那么还需要结合其表达情况评估细胞核机能状态, 对于需要进行刺激实验的研究者而言, 建议在正式实验之前开展预实验, 测试LPS或IFN-γ等刺激物的最佳剂量,以免过度激活致使细胞死亡, 同时确保能够引发预期的免疫反应。
