从事荧光定量PCR的人, 十个当中有八个都碰到过此类场景: 样本相同, 试剂相同, 然而跑出来的CT值却时高时低, 标准曲线的R²总也无法达到0.99。你再三核对程序, 检查加样情况, 结果依旧令人捉摸不透。实际上绝大部分重复性问题, 其根源并非在仪器自身, 而是潜藏于那些你视作平常的操作细节之中。
荧光定量PCR结果不稳先查这两处
好多人一旦瞅见扩增曲线杂乱无章, 首个念头便是更换试剂、调整程序。然而依据我这些年给他人排查问题的经验, 样本前期处理环节出现问题的比例要远远高于仪器故障。像RNA提取之后的纯度, 倘若OD260/280比值低于1.8, 其中残留的蛋白质或有机试剂会直接对后续的逆转录效率产生抑制。另外有的人习惯于把提取好的RNA放置在-20度进行保存, 多次反复冻融两三次, 检测结果当然每次都不一样。
加样环节是另一个极易被忽视之处。于八连管或者96孔板当中, 每个孔所加样量是否全然相同? 移液器枪头有无提前用样本进行润洗? 这些看似毫不起眼的动作, 累加起来便构成为几个CT值的偏差。提议所有样本均做三个复孔, 同时将同一批次的样本安排至相邻位置上, 如此即便存在系统误差, 亦能够借助内参基因予以校正。
荧光定量PCR的引物探针设计直接影响灵敏度
要是你的扩增效率始终在90%以下徘徊, 又或者熔解曲线出现杂峰, 那大概率是引物或者探针的设计不够理想。设计引物之际, GC含量最好把控在40%到60%之间, Tm值要尽量接近60度, 扩增片段长度处于80到150个碱基对之间最为恰当。好多人贪图便利直接照搬文献里的引物序列, 然而不同实验室的模板来源和仪器型号不一样, 实际效果或许相差很多。
从事探针设计，更需注重讲究之处, 探针的Tm值, 要比引物高出5到8度, 如此这般, 方可确保探针先于引物结合至模板之上。此外, 探针的5'端, 要规避多个连续的G碱基, 不然怎样, 会对荧光基团的淬灭效率产生影响。要是你所展开的是多重荧光定量PCR, 不同通道之间的荧光串扰, 也要预先进行测试, 尽可能挑选光谱重叠较小的染料组合。
仍旧存在一点是需要予以提醒的, 那就是关于标准品的稀释方式, 好多人惯常采用无酶水直接进行梯度稀释, 然而低浓度标准品易于吸附在管壁之上, 进而致使定量结果偏低, 推荐运用含有载体RNA或者鲑鱼精DNA的稀释液, 如此一来能够切实减少因吸附所造成的损失, 标准品分装之后进行冻存, 每次开展实验的时候取一支, 防止反复冻融。
话讲回来, 荧光定量PCR所具备的重复性以及准确性, 依靠的是针对每一个流程环节的细致掌控。从对样本展开处理开始, 历经试剂完成分装, 再到引物进行设计, 直至程序做好设置, 每一个步骤都值得你再多花费几分钟时间去予以确认。将这些基础性工作落实到位, 你就能够发觉那些长久以来源源不断困扰着你的问题, 实际上并没有你所想象的那般复杂。
