经年累月从事病原检测关联工作, 我曾操作过好多核酸扩增技术策划。RT-LAMP此一技术路径, 诚实地讲在等温状况下便可达成逆转录以及扩增, 对设备需求不高, 结果出具极快,切实化解了诸多现场侦测的棘手之处。然而市面上试剂盒品牌繁杂、 参数紊乱, 真正到了选型之际, 好多人反倒眼眸缭乱了。
反应速度与灵敏度如何平衡
不少人一开始就询问 “多久能够得出结果”, 这切实是 RT - LAMP 的关键优势, 一般 PCR 需要进行变温循环, 起始时间超过一个小时, 然而 RT - LAMP 是恒温扩增, 大概半小时左右便能完成。只不过速度快并不意味着灵敏度高, 看待这两者需要同时考量。
我见识过好些案例, 仅仅看着时间忽视了灵敏度, 最终致使低浓度样本出现漏检, 判定试剂盒优劣, 不可以只是听闻宣传所说的“20分钟出结果”, 而是要去查看它所标注的最低检出限, 例如每反应体系多少拷贝, 有的产品为了追逐速度, 舍弃了灵敏度, 当样本里病毒载量较低之时, 扩增曲线就无法上升, 极易给出假阴性结果, 所以在选型之际, 要把灵敏度指标放置在和速度同样重要的位置予以比较。
还有一点, 反应体系具备的稳定性也是相当关键的。存在一些试剂盒, 于实验室保持恒温的条件之下展现出良好的绩效, 然而一旦拿到现场, 由于环境温度出现较大幅度的波动, 又或者操作人员进行加样时的手法存在差异, 那么结果就会出现不稳定的情况。在这样的时候, 查看试剂盒是否拥有内置内参系统便显得尤为重要, 它能够对每个反应管的扩增效率予以监控, 进而防止出现假阴性的状况。
操作便捷性和结果判读方式
实际情况是, RT - LAMP最为主要的进行应用的场景实际上是处于基层这个范畴或者现场这个环境之中, 然而操作人员不一定会拥有专业层次的分子生物学方面的背景学识。所以呢, 试剂盒的预混体系是不是足够完善, 这直接就对上手时所面临的难度起到了决定性的作用。而质量优良的产品会将酶、引物以及缓冲液都预先进行混合调配好, 操作者仅仅需要添加模板以及水就可以了, 如此一来就降低了加样所涉及的步骤环节, 也就相应地减少了出现污染情况的风险。
使用体验受结果判读方式影响, 这一点同样如此。传统的琼脂糖凝胶电泳判读, 速度迟缓且缺乏安全性, 早就应当被淘汰掉了。当下主流形式是荧光定量或者颜色变化法。荧光法需要配备小型恒温荧光仪, 设备成本略微偏高些, 不过能够实时查看曲线, 数据具备可追溯性。颜色法更为简便易行, 依据肉眼直接观察颜色变化便能判断阴阳性情况, 适宜于现场进行快速筛查, 然而需要留意挑选颜色对比显著的产品, 以此避免出现判读误差。
除此之外, 防污染的设计同样不可被遗漏。RT - LAMP的扩增效率是比较高的, 其产物量也是比较大的, 在开盖进行检测之时, 是格外容易出现气溶胶污染的。质量优良的试剂盒会添加UNG酶体系, 或者是提供封闭式的检测管, 这能够在很大的程度上减少假阳性的风险。对于那些需要长期开展检测工作的实验室而言, 这一点相较于其他任何方面都是更为重要的。
终究而言, 挑选 RT-LAMP 检测试剂盒, 关键之所在是适配自身的运用场景。倘若实验室侧重于追求高通量以及数据完整性, 那就选择荧光法并搭配自动化配套；要是处于现场应急或者基层初筛的情况, 那就选择颜色法并搭配预混体系。将灵敏度、稳定性、操作便捷性这几个方面形成一个列表, 采用已知样本去开展平行比对, 这可比观看任何宣传册都更具效用。
