在分子生物学实验里头, PCR产物的纯化属于相当关键重要的一个环节, 不管是克隆, 还是测序, 又或者是后续阶段的实验运用, 高效的纯化都会直接对结果质量产生影响, 市面上各种各样品类的试剂盒多得满眼都是, 挑选出适宜的产品真的是须要进行一番研究才行, 这篇文章会从原理, 类型选择以及操作要点这三个方面来协助您弄清楚PCR纯化试剂盒的正确使用方式。
PCR纯化试剂盒的原理是什么
PCR 纯化试剂盒的核心原理是, 利用核酸在高盐低 pH 条件下, 与硅胶膜的特异性结合能力。当在 PCR 反应体系里加入结合缓冲液后, DNA 片段会和膜表面的硅羟基, 发生相互作用, 而引物、dNTP、酶等杂质却没办法结合, 会随废液被去除。随后借助洗涤缓冲液进一步清除残留的盐分, 以及有机溶剂, 最后在低盐或者纯水条件下洗脱, 就能获得纯净的 DNA 片段。
磁珠法纯化属于另外一条技术路线, 具备氧化硅包被特性的磁珠于特定缓冲体系里边吸附核酸, 凭借磁力架把磁珠跟液体分离开来, 经过洗涤之后洗脱获得纯化产物, 该方法不需要离心步骤, 适宜高通量自动化操作, 正被越来越多的实验室所采用。
两种方法各有优势，选择时需结合实验需求和通量要求综合考虑。
如何选择适合自己的PCR纯化试剂盒
市场上主流的PCR纯化产品大体能分成三种类别, 第一种是常规纯化柱, 它适用于多数标准PCR产物的纯化, 其回收率处于70%至90%之间, 能够满足测序与克隆的基本需求, 第二种是高 purity试剂盒, 它运用的是优化的洗脱缓冲体系, 可得到更高纯度的产物, 适宜对下游实验要求较高的情况, 第三种是专门用于小片段回收的试剂盒, 它针对100bp以下的短片段做出了特殊设计, 可以提高小片段的结合效率。
挑选之际要留意几个关键的指标之物, 回收率属于最为核心的参数内容, 其会直接对后续实验可以成功的概率产生影响, 纯度同样具备重要的性质, 特别是A260/A280比值以及A260/A230比值, 它们反映出蛋白质以及盐类杂质被去除的程度, 而操作具备的便捷性同样不能被忽视忘掉, 尤其是针对日常样品数量比较大的实验室, 步骤经过简化的产品能够显著提升开展工作的效率。
应当把价格因素置于最后予以考虑, 过于低廉价格的试剂盒, 有可能在回收率以及纯度方面存在着缺陷, 反倒将实验失败的风险予以增加了, 从整体的成本角度来看, 这样做并不具备划算性。
PCR纯化操作的注意事项
对实验成败起着决定作用的往往是操作细节, 加样环节是需要格外留心把控的关键环节, 缓冲液与PCR产物进行结合时, 其比例准确性是绝对不能忽视的, 比例过多或者过少都会对结合效率造成影响, 在二者进行混合操作时, 动作一定要极为轻柔, 防止产生气泡致使核酸出现损失情况。
在洗涤的步骤当中, ethanol添加量一定要被精确调节控制, 洗涤使用的缓冲液必须将膜表面充分覆盖住, 从而保证杂质能够被彻底地清理掉。在最后那次洗涤之后需要对于残留下来的ethanol做到完全彻底去除, 如果没有做到这样, 那么就会对洗脱效率产生影响, 甚至还会对下游应用造成干扰。
要进行洗脱环节, 推荐使用预热过的, 洗脱缓冲液或者无核酸酶水, 当温度较高之时, 核酸从膜上解离的效率会更佳。洗脱液的体积应该不宜过大, 一般情况下, 建议为30至50μl, 以此来保证产物的浓度。在洗脱时, 可把液体静置在膜上1至2分钟之后再去离心, 使得核酸拥有更充分的时间来解离。
经过纯化之后的产物, 应当尽快开展下一步的实验, 抑或是妥善地把它保存起来, 以此来避免因为反复冻融而造成DNA降解。
