常用于分子生物学实验室的荧光定量PCR技术，其得出结果的准确性跟重复性，与后续实验的成败直接相关。在实验中有好多人发觉，样本相同，试剂也相同，然而结果却不稳定。事实上，数据出现波动，常常是由于操作细节存在疏漏，我们能够从样本处理、反应体系、程序设置以及数据分析这四个关键环节逐个进行排查。
样本处理与提取效率
荧光定量PCR结果的基石是核酸提取质量，常见问题有提取过程里残留像乙醇、苯酚或者胍盐这样的抑制剂等，这些会直接抑制后续的酶促反应，建议采用高纯度的提取试剂盒，且在洗脱后凭借测定OD260/280比值来评估纯度，对于RNA样本，逆转录步骤的均一性同样是决定性的，务必要使用随机引物与oligo dT混合引物，以此保证不同区域cDNA合成效率相同。
引物探针设计验证
能够准确识别目标序列与否取决于引物以及探针的特异性，设计期间要杜绝引物二聚体或者发夹结构，要保证扩增片段的长度处于80至150bp之间。拿到引物之后，建议先借助普通PCR以及凝胶电泳去验证其特异性，查看是不是出现单一明亮条带。对于探针法而言，需要确认探针的Tm值比引物高5至8℃，并且要在黑暗环境里进行分装储存，以此防止荧光基团出现淬灭。
反应体系与程序优化
反应体系的配制乃是误差的主要源头，提出倡议采用预混液形式，把除模板之外的所有组分按照所需反应数加上一至两个的冗余数量先行予以混合，进而再分别装入到各个反应管里头，如此一来能够最大程度地削减移液误差。退火温度对扩增效率有着直接的影响，能够借助温度梯度功能探寻最佳条件。对于染料法而言，增添熔解曲线分析程序是验证产物特异性的必需举措。
数据分析标准统一
解析数据之际，因基线阈值确定所产生的人为方面的差异，常常会致使Ct值出现偏差。提议把阈值设定于指数扩增阶段的起始之处，一般选取荧光信号对数图里背景信号标准差达10倍的那个位置。针对同一批开展的实验，务必要运用统一的阈值来进行分析。一旦出现熔解曲线有着杂峰或者扩增曲线并非S型这种情况时，应当直接舍弃该孔所对应的数据，而不是强行把它纳入统计当中。
