荧光定量PCR是一项精准的核酸定量技术，它在生命科学研究领域发挥着重要作用，它在分子检测领域也发挥着重要作用。它通过实时监测PCR扩增过程当中的荧光信号，它能够准确测定起始模板的拷贝数，它与传统PCR相比具有更高的灵敏度，它与传统PCR相比还具有更高的特异性。掌握这项技术的关键点，对于获得可靠实验数据是至关重要的。
荧光定量PCR原理是什么
荧光定量PCR的关键之处在于借助荧光染料或者探针去标记扩增产物，最常被使用的SYBR Green染料能够嵌入双链DNA，随着每一轮循环产物的增多，荧光的强度会同步地上升，另外一种TaqMan探针法依靠荧光共振能量转移，探针水解之后会释放荧光信号，特异性更强，仪器实时记录每一个循环的荧光值，生成扩增曲线，通过设置阈值线得到 Ct值也就是循环阈值，该值与起始模板拷贝数的对数呈现线性关系，进而达成准确定量。
荧光定量PCR如何操作
实施实验之前，得去设计具有特异性的引物，以此来防止引物二聚体以及非特异性扩增情况的出现。反应体系一般涵盖着模板DNA、引物、荧光染料或者探针、dNTPs、DNA聚合酶还有缓冲液。建议去配制混合母液，目的是降低加样所产生的误差，针对每个样品要设置三个重复孔。将其放置到仪器上运行的程序含有预变性（95℃）、循环扩增（95℃进行变性，60℃实施退火延伸）以及熔解曲线分析（仅限于染料法）。要留意设置无模板对照以及阳性对照，进而监测污染状况。
荧光定量PCR数据怎么分析
得先查看扩增曲线是不是呈现出典型的S型，熔解曲线是不是单峰（以此来确认特异性情况）。拿对照样品当成校准依据，通常运用相对定量法（2^-ΔΔCt）去计算目标基因的表达变化。要保证扩增效率差不多接近100%，能够借助标准曲线的斜率来验证。绝对定量的话就得构建有着已知拷贝数的标准品，绘制Ct值跟拷贝数的关系曲线。分析期间把Ct值大于35或者重复孔标准差过大的数据给剔除掉，从而保证结果的可靠性。
