凭借着高灵敏度以及宽动态范围的荧光定量PCR技术，已然成为核酸定量检测方面的黄金标准，它借助实时监测荧光信号的累积的方式，从而将起始模板精确地定量成功实现，在基础研究跟分子检测领域发挥着不可替代的作用，能够掌握其原理以及操作细节，是获取可靠数据的前提条件。
荧光定量PCR原理是什么
它的核心是这个荧光定量PCR，是把荧光报告基团跟PCR扩增过程给偶联起来，每一个循环结束之后，仪器会记录特定波长下面的荧光强度，进而形成扩增曲线，通过Ct值也就是循环阈值跟标准品去进行比对，这样就能反算出待测样本的初始拷贝数，常见的检测化学原理存在SYBR Green染料法以及TaqMan探针法，这二者分别有着适用场景以及操作差异。
如何优化引物与探针设计
引物的设计质量，直接影响着扩增效率，探针的设计质量，也直接影响着扩增效率，引物和探针的设计质量，还直接影响着特异性。对于SYBR Green法而言，要确保引物二聚体的熔解曲线呈单一峰，还要确保非特异性扩增产物的熔解曲线呈单一峰。对于TaqMan探针法来讲，得将探针Tm值控制在比引物高5℃至10℃，并且要避免探针与引物形成互补结构。建议运用专业软件去进行二级结构预测，同时借助梯度PCR验证最佳退火温度。
Ct值异常怎么处理
Ct 值偏大，或者重复孔间差异过大，这是常见问题。首先，要检查模板质量，因为 RNA 或 DNA 降解，会致使信号延迟；其次，排查反应体系，看是否存在气泡或蒸发，这又会造成荧光采集波动。要是阴性对照出现扩增，那就表明体系被气溶胶污染，这时需彻底清洁操作环境，还要更换试剂耗材。每次实验，都应该设置无模板对照和阳性对照，用来辅助判读。
荧光定量PCR污染预防措施
比处理污染更为关键的是预防污染，要严格分区操作，即试剂配制区、样本处理区、扩增分析区相对独立，移液器、离心管等器材不得混用，使用带滤芯的吸头，在配制体系后采用UDG酶处理反应液，这样可有效降解含dU的扩增产物，定期用10%次氯酸钠擦拭台面，监测空管及水对照的扩增情况。
