荧光定量PCR原理是什么
荧光定量PCR，会于反应体系里加入荧光基团，以此实时监测每个循环的扩增产物量，当荧光信号累积到预设阈值的时候，对应的循环数被称作Ct值，Ct值跟模板起始拷贝数的对数呈现线性关系，所以能够精准计算初始模板量，和普通PCR不一样，它不需要终点检测，进而避免了产物抑制以及扩增效率差异导致的误差。
如何设计高效引物探针
引物进行设计的时候，要保证其长度处于18至25bp这个范围以内，GC含量得是40%到60%，还要避免出现连续相同的碱基以及二级结构。探针的位置应当处于两条引物之间，其5'端要标记报告荧光基团，3'端得标记淬灭基团。较为推荐应用专业软件去验证特异性，以此来避免引物二聚体以及非特异性扩增这种情况的发生。扩增产物的长度需要控制在80至150bp之间，要是过短就容易产生引物二聚体，要是过长则会降低扩增效率。
结果分析注意哪些细节
用于验证扩增产物特异性的是溶解曲线，目标产物单一呈现为单峰，提示存在非特异性扩增或引物二聚体是双峰。复孔Ct值标准差要小于0.2，不然就得检查加样操作或者试剂混合均匀度。阴性对照出现Ct值意味着可能存在气溶胶污染，需要彻底地清洁实验环境并且更换耗材。样本加样量不一致表明内参基因Ct值波动超过1个循环。
常见问题及解决方法
首先，当出现无扩增曲线的情况时，要优先去查看试剂是不是已经失效了，还要看看引物探针的保存条件是不是正确的。再者，Ct值偏大这种状况，常常是由于模板浓度过低或者是模板发生了降解而引发的，针对这种情况可以重新去提取样本，或者是增加模板量。还有，扩增曲线平台期下降的话，这就意味着荧光基团有可能脱落了，亦或是仪器的光学系统需要进行校准。另外，重复性差这种问题大多是源自加样误差，因此建议使用预混液并且校准移液器。而且，每次进行实验的时候都要设置阳性对照以及阴性对照，这样以此来确保体系是稳定可靠的。
