于免疫检测实验里，二抗身为贯通一抗与信号放大的关键桥梁，挑选以及运用适宜的二抗直接决定实验结果的可靠性跟重复性，众多操作者常常由于忽略种属、稀释比例或者交叉吸附等细节，致使呈高背景或者弱信号的状况出现，下面从三个实际环节着手，助力您系统地掌握二抗的使用要点。
二抗种属来源选择
二抗所对应的种属得是针对一抗宿主物种的那种，举例来说，如果一抗源自小鼠这种动物，那么二抗就得挑选针对小鼠的抗体才行，同样还要注意二抗自身所处的宿主种类型会对后续多重标记实验有些影响，要是需要同时测两个不同种属的一抗，二抗的宿主得相互去区分开来，以此避免产生交叉识别的情况，另外，经过亲和纯化而得到的二抗相较于抗血清产品其背景更低些，这样也就合乎适合做要求严格的实验这一情况了。
二抗稀释比例优化
不同品牌以及批次的二抗，其效价是存在着差异的，要是直接去套用说明书所推荐的比例，常常会出现信号过强或者是过弱的情况。故而建议先借助棋盘滴定实验来确定最佳的稀释倍数，一般这个范围是在1:1000至1:10000之间。另外稀释液的选择也是相当重要的，含有正常血清或者是BSA的缓冲液能够减少非特异性吸附。每次进行实验的时候都应该固定稀释条件并且记录工作浓度。
二抗交叉吸附验证
二抗与样品里头的内源性免疫球蛋白或者是其他蛋白出现非特异性结合，这就被称作交叉吸附。购买的时候要留意产品是不是经过了其他种属血清的吸附处理，像抗小鼠的二抗要是同时吸附了抗人、抗兔之类的血清，那么交叉反应的风险就更低这么回事。实在使用之前，建议拿只缺失一抗的样本当作对照，以此用来评估背景信号的来源。
