等PCR实验结果的那两三个小时是最磨人的，时间都耗费在扩增上面了。快速PCR扩增试剂盒就是为了解决这个痛点而存在的，它通过优化酶体系以及缓冲液配方，将原本一个半小时的跑胶时间压缩到了30 - 40分钟。接下来，我会从实际使用的角度出发，讲讲选购和操作时最应该留心的三个问题。
扩增速度如何提升
高速PCR的关键之处在于耐热聚合酶的改良，传统Taq酶的延伸速度大概是每分钟1kb，然而快速试剂盒选用具备高持续合成能力的突变体，其延伸速率能够达到每分钟4至6kb，不过速度提高不能在牺牲保真度的情况下进行，购买时要确定酶的错配率是不是在可接受的范围之内，同时快速度扩增需要与更短的热循环时间相配合，变性以及退火阶段通常只要1至5秒，这对于仪器的升降温速率有着一定的要求，建议优先搭配多区温控的PCR仪来使用。
试剂盒稳定性关键因素
不少人察觉到，几个月过后，快速试剂盒的扩增效率显著降低，这大多是因存储所致。酶制剂对反复冻融格外敏感，取出来后应当马上放置于冰上，用完之后需即刻放回零下20摄氏度处。另外，快速体系里的盐离子浓度较高，长时间存放会使沉淀析出，使用之前必须充分进行涡旋振荡而后短暂离心。建议进行分装保存，每一管的量足够一次实验使用用量，这样既能够避免反复冻融，又能够降低交叉污染风险。
适用样本纯度要求
快速PCR对于模板杂质的耐受程度比常规体系要低，原因在于其循环时间短，致使抑制剂没有充足的时间被稀释或者失活，常见的多糖、多酚以及血红素都会对酶活性产生干扰，要是样本来源繁杂诸如土壤或者血液，那么建议先实施磁珠法纯化，以此确保OD260/280比值处于1.8 - 2.0之间，在产物长度方面，快速体系最拿手的是500bp以内的短片段，一旦超过1kb那就有可能出现拖尾或者扩增失败的情况。
进行操作之际，还需要对退火温度予以优化，快速试剂盒一般会推荐通过梯度PCR去摸索最为适宜的条件，你是否遭遇过扩增产物出现非特异性条带这种情况呢，欢迎在评论区将你的实战经验分享出来。
