运用在流式细胞术中的抗体，乃是用于识别位于细胞表面或者细胞内部特定分子的工具。挑选适宜的流式抗体并且正确运转操作，直接就决定了实验数据的可信度以及重复性。在本文当中，将会从抗体选择开始到实验步骤再到常见问题，提供一套能够执行的参考方案。
流式抗体怎么选
最关键的准则是使实验样本物种跟抗体宿主物种相匹配，像是检测小鼠样本时，要优先选用针对小鼠种属的抗体，规避使用和样本同源的抗体，以此防止背景信号增强，荧光染料的挑选同样具有重要性，激光器以及滤光片的配置确定了可用染料的种类 ，得提前核查仪器参数。
用于克隆的编号所包含的信息是绝对不可以被忽视掉的。不一样的克隆编号在对同一抗原表位进行识别的时候会存在着差异，去查阅相关的文献或者厂家所验证出来的数据能够给予你一定程度上的帮助，从而让你能够找寻到特异性比较强的克隆。对于多色的实验而言，还需要对荧光溢漏这种情况进行评估，去挑选光谱重叠程度比较小的染料组合物，如果是这样的话，比如说FITC与PE进行搭配的情况就会比与PerCP-Cy5.5进行搭配的情况更加容易进行补偿调节。
实验关键步骤有哪些
第一步是样本制备，单细胞悬液质量对染色效果有影响，组织样本需充分将其解离，培养细胞要进行轻柔吹打，活细胞染色的时候，要避免剧烈涡旋把细胞膜遭到破坏，表面染色步骤相对比较简单，按照说明书加入抗体，在4度或者室温避光的情况下孵育15至30分钟就行。
针对胞内或者核内进行染色，需要增加固定以及破膜这样的环节，固定液一般采用4%多聚甲醛，而破膜要依据靶点所处位置来挑选皂素或者Triton X - 100，破膜时间要是太短，抗体就无法进入，要是太长，细胞散点图就会向前移动，每一步结束之后，要用染色缓冲液进行洗涤，以此来降低背景。
如何避免非特异性染色
原本并非特异性的信号，主要是源于抗体跟Fc受体的相结合，在进行染色以前，能够加入Fc Block试剂去封闭，特别是在检测巨噬细胞或者B细胞样本的时候，除此之外，抗体浓度要是过高，这属于常见的错误，建议先去做滴定实验，从而找到最佳的工作浓度，而不要直接去使用厂家所推荐的量。
借助同型对照，可助你判定阳性信号是否为真切的，挑选跟目标抗体属于同种属、同亚型且具有不相关特异性的抗体，以相同浓度进行染色，要是阳性管荧光强度显著高于同型对照，那就表明结果是特异性结合，别忘了设置未染色对照来用于调节电压以及补偿。
