荧光定量PCR技术，作为基因表达分析关键的重要工具，于科研试验里的应用尤为广泛。掌握其基本原理以及操作要点，此种情况能够助力实验人员获取更具准确、更可重复的结果。本文是基于实际实验经验，梳理出几个常见问题，而希望能够以此为同行供予参考。
荧光定量PCR如何选择荧光染料
被经常使用的荧光染料主要存在SYBR Green以及TaqMan探针这两种，SYBR Green支出成本比较低，适用于基因表达筛选以及熔解曲线分析，不过要对引物特异性予以验证，TaqMan探针凭借特异性杂交提升检测正确性，适宜多重定量以及低拷贝数靶标检测，只是探针设计中成本比较高，提议依据实验目的以及预算进行合理挑选。
荧光定量PCR的Ct值异常如何排查
衡量初始模板量的关键指标是Ct值，一般而言，其应处于15至35之间。模板浓度低，或者反转录效率差，又或者存在抑制剂残留，这些情况都可能致使Ct值偏大，针对此可尝试提高模板量，或者重新提纯RNA。引物二聚体存在，或者有气溶胶污染，这常常会导致Ct值偏小，或者无模板对照出现扩增，面对这种状况需要重新设计引物，或者清洁实验环境。
荧光定量PCR的熔解曲线出现双峰怎么办
通常情况下，熔解曲线双峰意味着存在非特异性扩增或者引物二聚体。首先，要对引物设计是否特异进行检查，防止与基因组DNA或者其他转录本有同源序列。其次，要对退火温度予以优化，借助梯度PCR找寻最佳条件。要是问题依旧没有得到解决，那么可以重新合成引物或者在反应体系里加入特定添加剂来减少副产物。
荧光定量PCR的结果重复性差如何改进
加样误差、仪器温度出现波动或者试剂批次存有差异，多会致使重复性差。建议运用预混液，并且校准移液器，针对每个样品设置三个技术重复。要保证实时荧光定量PCR仪校准状态是正常的，还要定期予以维护。与此同时，针对同一样品开展多次独立实验，计算变异系数，要是超过5%就需要重新优化反应条件。
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