卡在这个实验室里，我数不清了
夜班真的是个很玄的东西。
我之前觉得，只要严格按照说明书去做，实验就不会出问题。
后来我发现，我错了。
PCR试剂盒怎么选？
去年年底的那次失败。
我印象太深了。
针对同一个PCR试剂盒项目，我从三个各异的供应商那里取得了预混液，然而结果居然大相径庭。有一个信号强烈到极其夸大的程度，有一个仅仅是勉强能够投入使用，另外还有一个竟然什么都没有跑出来。
你可晓得我那时是怎样的心情呢？这般的感觉恰似煮了三锅面条 ，其中一锅硬邦邦的宛如石头 ，另一锅却已然化作了齑粉 ，仅有一锅呈现出恰到好处的状态。
实际上，问题在于聚合酶的活性方面。存在这样的情况，有的在运输期间温度并非足够稳定，待到达你手上时，酶已然死掉了一大半。你耗费了一个星期对其进行提取的RNA，以及设计的引物，全部都付诸东流了。
灵敏度这个东西，说明书上写得天花乱坠。
时不时就宣称“单拷贝级别检出率达百分之百”，然而一旦你切实朝着一个极低丰度的目标物，它大概就要对你显露出不满情绪了呀。
在进行低拷贝数靶标的检测工作时，最为困难的并非是操作这个行为本身，而是你所使用的PCR试剂盒究竟是否可以达到预期效果。存在一些试剂盒对外宣称能够检测出处于很低浓度状态的目标序列，然而在实际操作开展起来的时候却表现不佳。你需要去进行梯度稀释操作以此来进行验证，也就是从高浓度开始一直朝着低浓度进行稀释，进而观察该试剂盒的检出限究竟处于什么位置。这样的操作过程是非常耗费时间的，不过却是不得不去做的。
反复冻融的危害
我有个毛病，就是爱攒。
买回来的试剂盒，老是心里想着要“节省那么一点儿，下次的时候还能够用”，所以就不停地反复拿出来，又放回去。那结果是怎样呢？酶的活性变得越来越不好了，扩增效率呈直线状不断下降啊。
许久过后才终于搞清楚，反复进行冻融的话会生成冰晶，进而对酶的空间构象造成破坏。哪怕仅仅存在几次冻融的情况，酶的性能也会呈现出显著的衰减态势。
当下我收到试剂盒之时的首要第一件事情，即刻是赶忙去分装成为单次使用量的EP管。每一次进行实验之时拿出一管，使用完毕之后便丢弃。往后便决然不会再心疼那极其微量的点滴试剂了。
PCR试剂盒的保存温度
还有一件事。
先前实验室存在两台冰箱，一台恒定于零下二十摄氏度，另一台已然老化，其温度呈现出飘忽不定的状况。我随意地将一盒新近购置的PCR试剂盒放入了存在问题的那一台里，心里觉得理应构不成什么重大问题。
结果那批试剂做出来的结果，Ct值全部偏高，重复性差到离谱。
之后才排查清楚，之所以如此，是由于温度出现波动，酶的活性对于温度极为敏感，在零下二十摄氏度的环境里保存十二个月是不会存在问题的，然而只要温度一发生波动，酶就会开始成批地失去活性。
自那之后，我全部的新试剂盒，皆以专用冰袋予以运输，仔细严格记录温度，在收货之后，即刻放入稳定的低温环境之中。
污染的噩梦
做PCR实验，最大的敌人其实就是气溶胶污染。
有这样几种可能，其一，或许是你在开启盖子之际出现了不小心的状况，其二，也许是你所使用的枪头乃是未配备滤芯的那种，其三，说不定是由于你在配置体系之时，未曾佩戴口罩，也未曾佩戴帽子。
污染造成的局面究竟会呈现怎样的结果呢？假阳性大量出现，以至于泛滥成灾。阴性对照的那一条跑道毫无缘由地亮了起来，这种情况下，你整个人就陷入了懵然不知所措的状态。
后来我养成了一个习惯：
分成三个独立区域，分别是试剂准备区，样本处理区，扩增区，物品绝不能交叉使用。
用含滤芯的吸头；
操作前后彻底清洁工作台；
尤其是在扩增结束后，绝对不在PCR区域内打开反应管。
这些规定真的是用一次次失败的实验换来的。
RNA操作的“生死线”
如果你用的是逆转录PCR试剂盒，那挑战就升级了。
RNA这类物质，实在是娇贵异常啦。稍微有一点没留意，就会被RNase给降解掉，你费尽心力提取出来的样本一下子就化为乌有了。
我的方式为：全部的耗材都要保证不存在酶，台面运用RNase清除剂进行喷洒，RNA提取之际要保证样本充分地裂解，电泳的时候观察28S以及18S这两条主带的亮度，并且还要测量OD值以此查看纯度。
进行逆转录的操作过程之中，还必然得设置一个所谓的“无逆转录对照”——具体来讲，就是不添加逆转录酶，然后直接去开展PCR的操作流程，如果这个对照最终呈现出苗头，也就是出现条带的情况，这就表明你所提取的RNA里面存在着基因组DNA污染的状况，那么如此一来，定量的结果那可就没办法去看了。
快速PCR试剂盒的好处与风险
如果实验时间特别紧，可以考虑用快速PCR试剂盒。
原本需两小时的扩增，它压缩到半小时左右，这对于高通量筛查而言，简直就是救星。可是有一点需要注意，在速度提高了的情况下，灵敏度或许会有所下降。
扩展阅读：快速PCR技术应用指南
针对微量样本而言，老老实实选择用常规速度去进行操作，确保数据可靠才是最为关键的事情。
结果判读的那些坑
qPCR结束后，你会拿到一堆扩增曲线。
这些曲线的判读是一门学问。
合乎理想的扩增曲线应当是S型形态的，其中Ct值处于18至32这个范围之间，并且其熔解曲线会呈现出单一的尖锐峰。要是你的熔解曲线出现了杂峰的状况，那就意味着存在非特异性扩增的情况。
有可能是引物设计得不好，也可能是退火温度没优化到位。
惯例是，针对每个样本，都要去做重复孔，而后对重复孔相互之间，考察Ct的值的差值情况，一旦这个差异超出了半个循环之数，那么加样这一行为，就极有可能存在问题，那就非得重新再来一遭。
荧光染料的选择
要进行荧光定量时，会遇上一种抉择，那就是到底采用SYBR Green染料法，还是采用TaqMan探针法呢？
SYBR Green价钱较为便宜，适宜用于大量样本的初步筛查，不过需要借助熔解曲线来确认产物的特异性，TaqMan探针法价格更贵，然而灵敏度更高，适合对多重靶标进行同时检测。
选出哪一方，可不可以先瞧瞧实验室器具当中，荧光通道是不是契合，接着瞅瞅你的研究目标指向何方。
PCR试剂盒的性价比
近年来，国产品牌所生产的PCR试剂盒取得了十分显著的进步，其价格常常处于进口同类产品价格的三分之一至三分之二这个区间范围内。
具备的经验表明，针对常规的定性检测，以及基因分型这类情况，挑选性价比高的国产型号已然是完全能够满足使用需求的。然而要是涉及到低丰度靶标的绝对定量，或者有着要求极高的重复性，在某些场景当中进口品牌的确是表现得更为稳定的。仍然是需要在依据实验的实际需求的基础之上进行权衡的。
试剂盒的优化流程
一个新试剂盒买回来，最好先别急着上大实验。
一开始要用标准品去做一回预实验，去测试它的退火温度范围，测试它的灵敏度下限，还要测试它的扩增效率。要是属于通用型试剂盒，大部分是支持55至65℃的退火范围的，但其具体到你的引物兴许是需要些许调整的。
把这次预实验的参数记录下来，后面的实验就会顺畅很多。
“磨刀不误砍柴工”——这个道理在实验室里尤其适用。
从失败中走出来的经验
写了这么多，其实我最想说的是——
做实验最需要的，不是超级聪明的头脑，而是小心谨慎的习惯。
在每一进程之中，均依照既定规范予以施行，绝不存有偷懒之念，亦不怀有侥幸之心，一旦遭遇问题，多多展开分析，减少抱怨之情。
实验操作里，你所用的PCR试剂盒并非会欺骗你，而是会如实呈现你在其中留下的种种痕迹。那些看似存在“玄学”成分的失败情况，背后大多有着具体缘由，比如温度未把控好，操作规程不够严谨，某个细节被忽略了等等。把这些问题找出来，记录好，下次不要再犯相同错误。
原本是个经常陷入崩溃状态的新手，经由步步前行，直至如今成为还算能保持镇定的老手，我做到了。而你，能够达成优于我的表现 ，这是可以做到的。
