有时候我在想，当初是谁发明了抗体这东西。
实验室在凌晨两点的时候，空调发出嗡嗡的响声，好似一只正在打盹的猫。我注视着膜上那片令人讨厌的空白之处，心里琢磨着我究竟做错了什么事情。
这已经是第三次了。
一抗是什么
讲真的，于学校之中学习了好些年，切实让我弄清楚一抗究竟是什么，却是在第五次完成WB之后。
来这么理解，简单又直接：一抗是那种能够识别出你所关注目标蛋白的物质。它好似一把设计极为精细的钥匙，整个世界存在着几十亿把这样的钥匙，然而只有它能够插入到你那个蛋白所对应的锁孔之中。它是由B细胞分泌产生的，呈现为Y形的糖蛋白，外形相当美观。
但漂亮归漂亮，不干活你有啥用。
什么是二抗
曾经有同学向我询问过，为何一定要弄个一抗以及二抗这般麻烦，直接将一抗进行染色难道不行吗。
我当年也是这么想的。
后来师兄的一句话把我点醒了，去抓小偷时，一把电筒最多只能照亮你所看到的人，然而要是先拿探照灯把位置锁定之后再打开手电，那效果就会翻倍，二抗便是那个能帮你把手电信号放大的东西，一抗负责认人，二抗背上绑着荧光素或者HRP负责呼喊：“嘿！就是他！”。
一抗不发光，二抗才发光。
为什么我一抗老是不出条带
这是我最想骂街的部分。
上一批次一抗的好用程度简直达到了爆棚的状态，是同一品牌同一货号的产品，然而这次买到手的却连个模糊的影像甚至类似淡淡的投影都看不到。有一篇发表在《自然》杂志上的文章曾提及，宣称有三分之二的商业化抗体实际上完全没有按照所附带的说明手册来发挥其应有的作用。
也就是说，你花了钱，买回来的可能是一管生理盐水。
我曾目睹同组的博士，由于抗体失效，而被要求去补做实验，补不出来，最终撤稿。就连Nature都发文对这事予以提醒了，并非是我在胡乱瞎说。
一抗怎么保存
曾经我尤为吝啬，一支抗体反复进行使用，在兑了之后历经一年仍在使用。而后发觉每次条带愈发变淡，始终责怪自身转膜未曾转好。
其实是抗体死了。
现如今清楚了，一抗这个东西跟牛奶类似，要是反复冻融它就会坏掉。要进行分装，然后冻起来，使用的时候一次拿一管，别舍不得。稀释好的要放在4度，不过最好不要超过半年。
有时候想，那些二抗批是真心疼抗体呢，还是心疼自己的钱。
封闭
封闭到底是什么。
不要装作使用了多年却依旧讲不明白清楚，实际上就是运用牛奶或者BSA将膜上面那些不存在蛋白的空位用东西覆盖住，避免一抗向前跑去胡乱结合，是这样的情况。
头一回做WB，对封闭这事毫无知晓，最终显影时，整张膜亮得仿若北极光那般，压根没法分清哪条是自己所需的条带。导师路过瞅了一眼，未发一言，叹息着离去了。
那口叹气我现在还记得。
5%脱脂奶粉，室温摇1小时。别偷懒。
单克隆还是多克隆
选什么，看你做什么。
单克隆具备的特异性十分强，恰似一把精度精到小数点后三位的枪，多克隆拥有的灵敏度很高，一梭子弹发射出去好几个表位都能够命中，然而却易于打偏，背景呈现出脏污的状况。
做WB 时我采用的是单克隆，做 IHC 时我选用的是多克隆，实际上并非有着极为严格的规定，仅仅是一种感觉。
存在同学，非要与我进行抬杠，宣称某某文献当中，使用单抗去做IHC也是可行的。行吧，那就让你去做，我不会阻拦的。
种属
如果说一抗最大的坑是什么，那就是种属配错了。
一抗源自兔子，二抗买的是羊抗兔。然而，羊抗兔没问题，只是那只羊或许感冒了，导致二抗活性糟糕透顶。亦或是更离谱的情况，买成了鼠抗兔，而你却稀里糊涂没察觉到一抗混进去了。
每每前去购置二抗之际，我都必须将冰箱翻找出来，目不转睛地注视着那一管一抗，持续十秒钟之久，从而用以确认宿主。小鼠，大鼠，兔，山羊。此四种动物，皆对接下来一个月你的悲欢离合起着决定性之作用。
有时候会想，如果我是兔子该多好。
稀释比例
说明书上写的1:1000只是参考，不是真理。
我常常依照这个比例起始往下进行切割，比例分别是1:500，1:1000，1:2000以及1:4000，将它们全部逐一运行一遍。哪一条具备较宽的带宽，哪一条拥有更为干净的背景，就是哪一个。
可是存在一些抗体，你与它进行商讨是起不了作用的，试图讲价同样是没效果的，它就是坚决要在比例为1:1500的情况下才开始发挥作用。所以呢，那就多进行切割吧。
一抗稀释液里加点叠氮钠，4度能多放一阵儿。但别指望太久。
孵育
以往我个性急躁，37度摇晃两小时便完成。随后发觉经过过夜进行孵育所产生的条带如同更换了抗体一般。
此刻，我皆是在4度的环境里过夜，反正啊，冰箱是这般大，不过是多睡上一觉罢了。实验呢，有时候就是一个熬的过程。
师兄在当年的时候，讲过一句直至如今我都还记得住的话语：进行着的实验倘若速度过快，也不会有任何人来给你颁发奖项，暂且等待一下，又会产生怎样的状况呢。
背景脏是什么原因
哪有什么玄学，都是自己的问题。
封闭不好，背景脏。一抗太浓，背景脏。洗涤不彻底，啥都脏。
那一阵子，我洗膜的时候，只是走过场般随便用TBST冲两下就当作完成了，结果呢，每次把膜拿出来一看，就跟京剧脸谱似的，样子很难看。后来变乖了，乖乖地洗三次，而且每次洗五分钟，之后世界就清净了。
以前还会骂抗体不行，现在第一反应是，我自己洗干净了吗。
为什么二抗一定要和一抗匹配
小学逻辑题而已。
一抗究竟是源自何处呢，二抗就必须得能够辨别出那个来源。针对鼠抗此项，你应当选用对抗鼠类的二抗，针对兔抗这种情况，你则应当选用对抗兔类的。
如果不匹配，就跟让猫去认狗的脚印一样，白忙活。
我存在一个师妹，其特别的轴，非要说能够使用驴抗鼠的去辨认兔源的，我进行了三次劝说，她都没有听从，之后她出现条带减少三个的情况后，自己才明白过来。
内参
内参是什么？是房子里的尺子。
在你察觉到目标条带呈现出时而出现、时而消失的状况之际，你便会萌生出这样的想法，即是不是上样量存在着不一致的情况呢。于此同时，去跑一个内参，比如actin也好，或者GAPDH也罢，瞧瞧这两条带是否整齐划一。要是内参不整齐，那么在此之前的所有分析就全然是毫无根据的瞎扯了。
我头一回撰写论文之际，被审稿人指出了这一条，这才察觉到原来这个东西是这般重要。
标签抗体
接一个标签在目标蛋白的后方，随后直接去购买那个标签的抗体，如此便能省去自己进行纯化的操作了。
最常用的是His-tag以及Flag-tag，标签抗体着实省心，比你亲自去做具有特异性的抗体要靠谱得多，并且还便宜。
要是让我针对刚踏入实验室的新人给出一条建议，大概便是，倘若不存在非得使用自身所制备的特异抗体的那种执念，那就选用带标签的吧。
写在后面的话
我的现有习惯为，每当拿到新的抗体之时，首先去做一个对照，以此来确认它确实是在发挥作用。不然的话，在做了长达三个月之后才发觉抗体是存在问题的，那种感受，要比经历失恋更为难受。
推荐你们也试试这一步。
