那天早上，我打开冰箱，发现那支流式抗体又沉淀了。
心凉了半截。就剩最后一批样本了。
我知道，很多人在这一步就栽了。包括我。
流式抗体怎么选克隆？
看货号？不，看克隆号。
同一个靶点，不同克隆，结合表位可能差十万八千里。
这个亏我吃过，CD4选择了一个RPA-T4，结果小鼠样本死活染不上。
荧光染料怎么搭？
别信“亮度越高越好”。
PE、APC这种亮，但光谱重叠能让你哭。
曾经有一回，我采用了FITC以及PE共同进行染色，补偿调试到令人对人生都产生怀疑的程度，数据全部呈现为倾斜状态。
后来学乖了：弱表达用亮染料，强表达随便。
流式抗体滴定有必要吗？
以前觉得这是大神才做的事。
直到某天心血来潮滴了一次。
我靠，原来说明书推荐的量，背景高得离谱。
减半后，信噪比翻倍。省抗体，省银子。
流式抗体保存温度多少？
4°C？-20°C？反复冻融？
记住：大多数就是4°C，避光。
我同事有次把整盒放进了-20，解冻后全成了絮状物。
那眼神，我现在还记得。
同型对照真的有用吗？
有用，但你得买对。
别拿IgG1做对照，然后靶标是IgG2a。
我干过这事。被师兄骂了半小时。
同型对照是用来评估非特异性结合的，不是随便找个同型就完事。
还有，浓度要和实验抗体一致。不然白做。
流式抗体染色时间多久？
冰上30分钟？室温15分钟？
看说明书。但也要看细胞死活。
有一次我染了2小时，细胞都漂了。
结果出来全是碎片。哭都没地方。
一般而言，十五至三十分钟便已充足，要是时间过长，非特异性就会提升，细胞亦是承受不了的。
固定破膜怎么做？
染胞内的话，固定液别用太猛。
4%多聚甲醛，15分钟，够了。
破膜剂选温和的。皂素那种，时间别长。
我偷懒用过一次甲醇，细胞形态全毁了。
多色panel怎么设计？
原则：弱表达配强染料，稀有的配亮色。
光谱重叠要错开。别把FITC和PE放一起测低频抗原。
我先前做8色，硬是塞进了PE - Cy7以及APC - Cy7，结果补偿矩阵变得混乱不堪，如同搅成了一锅粥。
后来老老实实用光谱流式或者减少颜色。
现在每次开新抗体，我都先做滴定。
专门弄好了一个小抽屉用来保存，抽屉具备避光的特性，温度保持在4°C，并且在门上张贴了“流式抗体专用”的标识。
上次隔壁实验室来借，我说不行，怕他们冻错。
他们说我小气。我笑笑。
有些坑，踩过一次就够了。
