说真的，搞PCR实验这几年，最烦的就是配体系。
每一回新购置一对引物，内心便开始忐忑不安——退火温度该设定为多少呢？Mg²⁺浓度需不需要进行调整呢？模板添加过多的话，非特异条带便会到处都是；添加过少的话，就直接没有信号了。最为让人崩溃的是，折腾了一整个白天，跑出来的胶就如同鬼画的符一样。
我真的，有一阵子看见PCR仪就想吐。
此后实验室交换了一批具备通用性的 PCR 试剂盒，最初的时候我是相当不屑的，所谓通用，究竟能有怎样的通用程度呢？难道不是又在夸大其词吗？
结果真香了。
什么是通用型PCR试剂盒，真的能通吃所有模板吗？
先别急着喷，我得说清楚。
通用型PCR试剂盒并非那种虚无奥秘不实之谈，它是将聚合酶、缓冲液、dNTP、Mg²⁺这般事物，运用一套极为特别优化的配方进行打包组合，你只需加入引物以及模板，将其放置到机器里面，便完成所有操作了。
关键在这——它优化的是“容错率”。
并非是讲无论你怎样随意胡乱去操作都能够P出来，而是在说你没必要再跟退火温度一直纠缠较劲了。正常情况下设计一个引物，其Tm值处于50到65度之间，随便设定为55度，基本上都能够出现PCR条带。
尝试运用它去扩增那个含有百分之七十五GC含量的片段，还曾对AT-rich区域进行扩增，居然全都还算可以。并非是那种仅仅“勉强能够看得过去”的水准，条带清晰可见，亮度处于正常状态。
为什么我换了好几个品牌，最后又换回来了？
这事儿说来挺逗。
启初之际贪图价格低廉，遂购置了A品牌的，价格低廉确属事实，一盒尚不足两百块，然而经处理显现之物，非特异条带相较于目的条带更明亮，予以进行凝胶电泳操作，竟能呈现出“DNA阶梯升级版”。
随后更换成了B品牌，是进口的那种，贵到让人肉疼不已。其效果的确是好的，然而问题在于太过娇贵了。只要稍微在室温放置久一点，活性就会下降。有一回实验室出现停电情况，冰箱温度上升到了8度，那一整盒基本上就报废了。
C品牌，是经朋友推荐而来的，朋友表示实验室都在使用它。我使用了一回，其退火温度窗口极为狭窄，只要稍微差上两度，便不会产生产物了。
绕了一大圈，最终又再度使用起当下这个具有通用性的试剂盒，其价格居于中等程度，重点在于具备稳定性，将它放置于冰箱之中长达半年时间，取出后加以使用，仿若崭新如初。
通用型试剂盒的扩增效率，跟普通的有啥区别？
这个问题我特地问过做技术支撑的朋友。
他讲，通用型试剂盒当中的聚合酶，一般是经过工程改造的，并非天然的那种形态，是借助定点突变或者融合表达，以使它对于反应条件并非那么敏感。
说白了，就是把一个“暴脾气”的酶，改造成了“老好人”。
就扩增效率而言，相较于专门针对特定模板进行优化的试剂盒，的确会低那么一点点 ，但要注意，仅仅是“一丢丢”。当运用qPCR Ct值加以比较时，或许会相差0.5到1个循环。
但在普通PCR里，根本感觉不出来。
并且，通用类型的延伸速率常常要更快些。缘由在于酶已历经改造，合成速度得以提升，六十秒能够延伸超出两kb。针对多数一kb以下的片段而言，三十秒的延伸时长便足够了。
时间省下来，一天能多跑好几块胶。
用了通用型试剂盒，是不是就不用再优化体系了？
别做梦了。
任何试剂盒都救不了糟糕的引物设计。
我存在一位师弟，其引物二聚体已然跑出呈现出“灯塔”般的效果了，然而他却责怪试剂盒是不行的。我将其拿过来进行查看，发现Forward引物以及Reverse引物的3‘端存在着6个碱基是互补的。这样的情况要是能P出来那才是怪事呢。
通用型试剂盒能够帮你省去的是，退火温度梯度，Mg²⁺浓度梯度，模板梯度，循环数优化，这些麻烦事。
不过呢，它没办法帮你处理好这些情况：引物自身存在互补现象，模板的质量糟糕至极，GC含量高于70%同时长度超出2kb，又或者模板之中含有较强的二级结构。
这些老问题，该手动优化的还是得手动优化。
那我怎么判断，这个活能不能用通用型试剂盒搞定？
经验之谈，看三点。
DNA提取状况下的模板质量情况，要是你所进行的DNA提取效果相对较好些，于OD260与280的比值处于1.8至2.0这个区间以内，并且不存在较明显的降解情况发生，那么很大可能性它是能够被使用的。
片段的长度，专门普遍使用的试剂盒所推荐的片段长度通常是在4kb以下，要是超过了4kb，那么建议更换长片段专门使用的试剂盒。
当你的引物，是那种经过BLAST 验证的，并且基本上不存在非特异性结合位点的，才能够放心去使用其引物特征所呈现出的特异性。
要是这三个条件均达成，然而却依旧无法P出来,先别忙着去斥责试剂盒，先瞅瞅你的PCR仪温度校准是否出现偏差了。我们实验室所使用的那台PCR仪，历经三年都未曾校准过，实际的温度相较于设定温度低了3度。更换了一台机器后，问题就全部得以解决了。
说个题外话，PCR仪这东西，真要定期维护。
试剂盒里的聚合酶，会不会有批次差异？
肯定有。
这是个没办法全然规避掉的问题,毕竟酶是生物体所生产起来的，并非通过化学合成而得来的,不同批次的酶，在比活、其热稳定性、保真度这些方面，都会存在着细微的差异。
但好的品牌会把批次差异控制在一个合理的范围内。
怎么判断？看质检报告。
正规厂家，在每批试剂盒出厂之前，都会实施做QC的操作 ，运用一套标准模板以及引物 ，于特定条件之下开展做PCR的行为 ，接着进行跑胶的流程 ，查看条带亮度 、位置 、以及有无非特异带的情况 ，质检报告当中会附上这一批次的胶图。
要是你察觉到刚买的试剂盒，跟自己先前使用的在效果上存有差异，且不必急着去退货，能够取实验室中留存的“标准模板”进行一次测试，再去对照一下先前的数据。
如果差异太大，再联系厂家。
对了，提及一个极易被忽视的要点——试剂盒的保存条件，某些实验室的冰箱温度存在较大波动，或者时常有人将试剂盒拿出使用后却不将其放回原处，如此这般也会致使效果处于不稳定状态。
真的不想再配体系了，能不能就加样然后直接跑？
能。
当下诸多通用型PCR试剂盒，均推出了“预混液”版本 ，你所购置回来的乃是一管2x浓度的Mix ，其中涵盖了所有所需成分 ，你仅需添加模板 、引物以及水。
然而存在一些更趋于极致的，乃是“冻干粉”版本，整个反应体系于管子当中被冻干，你只需加水进行重悬操作，接着再添加模板以及引物便可，这物品在室温状态之下能够保存一年时间，格外适宜野外采样的情形或者实验室冰箱存储空间不足的状况下使用标点。
然而，冻干粉的外部呈现为软管形态，并非ep管，在进行加样操作期间，务必要予以留意，千万不能够将管子弄破了呀。
那我现在该不该换成通用型的？
看情况。
果断换，要是你所进行的是常规克隆，是基因分型，是菌落PCR，又或者是简单的定性检测。
要是你所从事的是那种对质量精确程度要求极高的克隆操作，像是全长基因合成这种情形，又或者模板极为珍贵稀缺，再或者片段长度超出了5kb，那么这种情况下选用专门的试剂盒更为妥当可靠。
话说回来，对于大部分实验室日常所开展的实验而言，通用型的PCR试剂盒是完全能够满足需求的。
不是因为它最好，而是因为它最简单。
省下来的时间和精力，拿去谈恋爱、打游戏、追剧，不香吗？
不管怎样，我已然没办法再回去了。眼下，实验室里存在着一些人，他们依旧在为退火温度而纠结，我望着他们，就恰似看待往昔的自己一样。
