为什么你的PCR总比别人慢半拍？
实验室里等结果的时候，那感觉真不好受。
瞪着瞧那台PCR仪, 瞅着进度条一格一格地跳动 , 心里思索想的尽是下午能否准时下班 , 或者是否能够抢就在竞争对手之先把数据拿到手。
尤其是在做大批量样本的时候，那种等待的焦躁感，是真的磨人。
实际上, 问题并非仅仅存在于机器方面, 在不少情形之下，试剂盒自身才是那个起到阻碍作用的环节。
快速PCR扩增试剂盒，快在哪里？
很多人觉得, 那所谓的“快速”, 是酶添加得更加多些, 或者是程序设置得更为短些。
没那么简单。
在于聚合酶的进化, 这才是真正的快速PCR扩增试剂盒的核心所在。
可不是那种平平常常的Taq酶, 而是历经工程化改造而成的。简单讲, 即是使这个酶于高温状况下更具活力, 延伸的速度更为迅速, 并且保真度也不存在问题。
传统的PCR, 在72℃进行延伸时, 一秒钟大概能够延伸1000个碱基, 然而快速版的, 在同样的时间之内, 它还能够跑2000个甚至更多。
这就好比同样是跑步，别人是慢跑，它是冲刺。
扩增效率高，意味着什么？
意味着你的循环数可以减。
常规PCR常常会有35个循环、40个循环的情况, 快速试剂盒呢, 有可能28个循环、30个循环就能够完成。并且一个循环能节省几十秒, 经过几十个循环之后, 所差的时间就是十几分钟抑或是半小时了。
别小看这半小时。
面向那种一天得跑好几板样本的实验室而言, 这意味着效率实现翻倍。就临床检测来讲, 早出结果半小时, 说不定病人就能少等半天。
此外, 速率高并不意味着品质劣。优良的迅速PCR扩增试剂盒, 专一性反倒更卓越, 非专一性条带更稀少。
何故? 缘反应时间短促, 那些存有“偷懒”行径的引物二聚体以及错配状况, 还未曾来得及构筑而成时, 反应便已然终结了。
但快，也有快的烦恼
有些实验室试过快速试剂盒，回头又换回普通的了。
为什么？觉得不稳定。
并不是快速试剂盒本身不稳定, 而是你的体系与它尚未磨合好, 事实上这是误解。
譬如, 模板质量欠佳, 存在抑制剂。普通试剂盒反应迟缓, 却能承受；快速试剂盒反应迅疾, 抑制剂尚未来得及被“稀释”消解, 它便停止运作了。
这不是试剂盒的问题，是样本处理的问题。
举例来说, 又存在这样的情况, 引物的Tm值被设计得过低, 快速PCR的退火时间极为短促, 引物无法与之接合, 扩增效率自然而然就会降低。
所以, 使用快速PCR扩增试剂盒, 并非单纯地进行替换即可, 而是需要对实验习惯予以略微调整。
怎么判断一个快速试剂盒好不好？
别光看它宣传页上写的“30分钟完成”。
你得看它在什么条件下30分钟完成。
是拿着纯粹无杂质的质粒DNA去跑的吗? 还是拿着像血液、组织裂解液这类成分繁杂多样的样本去跑是呢?
是单重PCR？还是多重PCR？
本来多重PCR做起来就困难重重, 对试剂盒的要求极为严苛极高。要是有一个快速试剂盒, 在多重体系的状况之下, 仍然能够维持高灵敏度以及高特异性, 那这才算是实实在在的真本事呢。
还有一个关键指标：宽广的GC适应性。
存在着这样一些模板, 其GC含量处于较高水平, 二级结构具备较强特性, 扩增起来难度极大。普通的试剂盒, 或许需要添加DMSO、甜菜碱这类添加剂。而性能优良的快速型试剂盒, 自身便能够攻克这些棘手难题。
用了快速试剂盒，能省什么？
时间，是最明显的。
但还有别的。
电泳的时间, 其扩增效率处于较高水平, 产物浓度同样处于较高水平, 在进行跑胶操作时, 无需加入那么多量 , 少跑几分钟, 这也是一种节省。
这种情况的复检率, 其具备良好的特异性, 非特异性条带数量少, 在进行判断结果操作时无需陷入纠结状态, 也无需重复进行实验操作, 如此节省了试剂以及精力。
并且, 仪器的运用效率情况。相同的时长, 原本仅仅能够运行一轮, 如今却可以运行两轮。仪器的折旧耗费成本, 均匀分摊至每一个样本之上, 就有所降低了。
这些账，实验室负责人心里都有一本。
一些真实的感受
用过几个牌子的快速PCR扩增试剂盒。
存在部分情形是速度着实快, 然而价格却贵到超乎想象。存在部分情况是价格较为便宜, 可是稳定性欠佳, 时不时会出现莫名状况。
极其理想的情形是, 那种速度已然提升上去了, 价格并未涨至太多的程度, 并且批间差处于稳定状态的。
对，批间差很重要。
你这一批次的实验展现出了良好的效果, 然而下一批次更换了批号之后, 却出现了问题。如此一来, 先前进行的所有优化, 全都付诸东流了。
所以，选择一个靠谱的品牌，比单纯看参数重要得多。
最后说点实际的
要是你的实验对于时间方面的要求并非很高, 并且样本量同样不是很大, 实际上并没有必要跟着别人的做法去更换快速试剂盒。
倘若你的流程当中, PCR属于瓶颈所在, 每日均存在堆积如山的样本亟待进行扩增, 那么花费些许时间, 严谨地对一款能够实现快速扩增的PCR试剂盒予以评估, 绝对是颇具价值的。
找一个有技术支撑的供应商，拿自己的样本去试试。
别只看说明书，也别只听销售讲。
跑一板，就知道了。
毕竟，数据不会骗人。
