刚进实验室那会儿，我最大的噩梦就是PCR。
并非不具备做的能力, 而是等待的时长过于漫长了。去扩增一个目标片段, 动不动就要耗费两三个小时之久, 有时进行个梯度操作或者重复一遍, 一整天的时间就这样被消耗进去了。更为让人崩溃的是, 晚上九点的时候把体系加好, 机器发出嗡嗡的转动声, 你必须得在旁边守着, 就怕它在中途出现什么意外状况。
随后, 我尝试了一些被称作“快速”的试剂盒, 该怎么讲这个事情, 要么是酶的活性不足够, 要么是延伸的时间根本基本上没有缩短多少, 好不容易将其跑完了之后, 条带居然还出现拖尾的情况……这简直把我气坏，气得我差一点就把移液器给扔掉了。
我推测你也碰到过相似情形, 样本数量众多, 时间十分紧迫, 老板催促得极为急切, 然而偏偏在PCR这个环节遭遇阻碍, 你或许尝试过调整程序, 将退火温度提高两度, 亦或是把循环数减少一次, 但其效果微乎其微, 跑出来的结果要么没有产物, 要么就只是一个模糊的影像。
这试剂盒到底快在哪？
并非所有被称作“快速”的试剂盒确实具备飞快运行的特性, 有些仅仅是美化了标签, 然而实际运用时与平常普遍的并无本质差异, 可是此物品并非如此, 它内部的那种酶是经过特意改造的。
该怎么表述呢, 普通状的Taq酶每分钟大约可以延伸1000个碱基, 而这个却能够做到3000至5000个碱基那般。你能够算计一算, 像一段3kb的片段, 普通的酶得延伸3分钟才可以完成, 它呢一分钟便做得到搞成。按照惯用的30个循环来算, 节省出来的时间足足有一个多小时之多。
何况它并非借由牺牲特异性来换取速度, 我对它的保真度做过测试, 与高保真酶相较, 相差无几, 即便 GC 含量高的复杂模板它也能够进行扩增——以往遇到 60%以上的 GC 区段时, 我都会提心吊胆、捏着一把汗, 如今却是安心了许多。
那退火温度怎么设？
对于这个, 好多人会问: “退火温度是不是得再次去摸索确定? ”实际上没必要过度纠结。它的buffer当中添加了优化因子, 对于引物Tm值的容忍程度比较大。以往你计算得出是58度, 那就得严格依照58度去操作, 稍微偏差个一两度就有可能没有产物。
此刻你大概于五十五度到六十度之间设定一个数值便是可以的。我个人的习惯乃是比引物Tm低三度, 每一回都出现条带, 清晰干脆。
就是说, 当你所面对的模板呈现出特别复杂的状况时, 像那种从石蜡包埋组织里提取出来的DNA, 又或者是环境样本这类的, 在此情形下, 建议你把退火时间设定在15秒至20秒这个范围之内, 千万不要去采用默认的10秒时间, 这么做的目的在于能够给予引物和模板足够充裕的彼此接触时间。
延伸时间要怎么调？
这属于极易被忽视的所在之处, 好多人获取到快速PCR试剂盒后, 依旧依照以往的规则以1kb一分钟的方式来设定延伸时间, 如此这般便未能将其优势予以发挥出来。
在目标片段小于1kb的时候, 延伸时间能够设定为10到15秒；在1kb到3kb的状况下, 延伸时间设置成25到30秒；当处于3kb到5kb的范围时, 40到50秒就足够了。针对于超过5kb的大片段, 我给出的建议是采用慢速酶更为稳妥, 毕竟片段越长出现错误的可能性就越大。
又存在这样一种情形——你所进行的是多重PCR, 有好几对引物会同时去扩增不同大小的片段, 在这种时候, 延伸时间要依据最长的那个片段来计算, 比如说, 最小的片段是200bp, 最大的片段为2kb, 那么你就得设置30秒, 以此来确保大片段能够得以完整扩增出来。
模板用量要不要减少？
我曾纠结过这个问题, 是由于酶活性提高, 基于理论而言模板能够少添加, 随后进行了几次尝试, 发觉的确可行。
对于普通PCR, 我通常添加五十至一百纳克的基因组DNA, 采用这个试剂盒, 二十到三十纳克便能得到清晰的条带。要是你是从血液或者细胞中提取的, 模板量原本就少, 这个优势就极为突显。单细胞PCR甚至仅用一纳克都曾成功过。
然而存在一点需留意, 切莫过度去稀释模板, 特别是针对低质量的样本而言。就像经过福尔马林固定的组织DNA, 其降解状况颇为严重的, 要是模板量过少的话反倒无法扩增出来。建议先去跑一次梯度尝试一下, 具体是10ng、20ng、50ng, 瞧瞧哪个浓度下能获取到最亮的条带结果。
循环数该怎么确定？
一般情况下的PCR大多是35个循环, 快速PCR由于每个循环所耗费的时间比较短, 不少人认为能够多跑出几个循环以此来进行弥补, 实际上并没有这个必要。
于我而言的经验状况为, 30至33个循环的数量是足以充分满足需求之情状的。除非是你的模板浓度处于极低的程度, 又或者是目的基因的拷贝数少之又少的情况之下, 才会考虑将循环数量增加至35个。要是多于35个循环, 反而极易产生并非特异性的条带, 进而致使背景变得杂乱、污脏。
第一步, 你能够先去运行30个循环, 进而查看一下结果。第二步, 要是条带呈现出较弱的状态, 那就添加3个循环。第三步, 要是条带已然非常亮了, 那就不要添加, 因为有时候过度扩增会对后续的测序或者克隆实验产生抑制作用。
有没有什么小技巧？
还真有几个。
热盖的温度设置不宜过高, 某些PCR仪默认热盖加温至105度, 然而快速PCR由于反应时间短暂, 若热盖温度设置过高, 反而会致使反应液出现蒸发的情况, 故而建议将热盖温度设定为100度即可。
预变性所需的时间没必要过长, 普通PCR的众多试剂盒所推荐的进行预变性所经历的时间是3到5 分钟, 而这个仅需2分钟, 浓度相对高一些的热启动酶甚至只需1分钟便足够, 节省下来的每一分钟, 积累起来数量就十分可观。
有实验指导书所写的是, 应将反应体系设定至二十五到五十微升之间, 然而, 使用这个试剂盒, 你完全能够把体系减少至二十微升, 如此一来, 试剂成本会直接下降。关键之处在于, 二十微升体系与五十微升体系所形成的效果几乎并无差异, 至最终时, 条带亮度大致相仿。
PCR产物能够直接被用于下游的实验, 并不需要再去进行纯化或者沉淀的操作。我尝试过将DNA聚合酶链式反应产物直接送去测序, 测序得到的峰图表现良好；进行TA克隆同样不存在问题, 转化效率处于正常的状态。这样便省去了一个纯化的步骤, 大概耗费的时间又节省了半小时。
什么时候不应该用这个？
我不是说它万能。
换种情况来说, 要是你打算去扩增超过10kb的长片段, 又或者模板是那种高度降解的FFPE样本, 比起快速酶来讲, 传统慢速酶反倒会更加靠谱些。快速酶特别追求速度以及效率, 对模板的完整性是有着一定要求的。一旦模板糟糕透顶, 即便它跑得再快, 那也是毫无作用的。
再比如说, 倘若你要去开展极为精准的定量PCR, 那种快速酶在终末期所呈现的平台期效应, 与普通酶是有所不同的, 若如此, 建议还是选用专门予以设计的qPCR试剂盒。而这个试剂盒, 对于普通PCR以及克隆用途而言, 会更加适配。
, 想起来了, 要是你从事的是大批量样本的筛选工作, 就像进行几百个菌落的PCR鉴定那样, 那它绝对堪称神器。每一个反应能够节省1小时, 若是有一百个样本的话, 就能节省出一整日的时间。
写在最后
永远都是要设法挤出用时颇多的实验室的时间的。试剂盒快速PCR并非是供您偷懒的, 而是要让您把节省下的时间用在更具重要性的事情之上——像是去做设计更为出色卓越的实验, 亦或是与师哥师姐探讨交流结果, 甚至是能够提前返家好好睡上一觉。
你试一下就知道了。
