碱性磷酸酶（AKP/ALP）检测试剂盒

碱性磷酸酶（AKP/ALP）活性测定试剂盒说明书

                                                   微量法 100T/48S

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：                       

AKP/ALP是一种含锌的糖蛋白酶，在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。AKP/ALP广泛分布于人体各脏器中，以肝脏为主。 

测定原理：

在碱性环境中，AKP/ALP催化磷酸苯二钠生成游离酚；酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510 nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。

自备实验用品及仪器：

可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1瓶，4℃避光保存。a

试剂三：液体×1瓶，4℃避光保存。

试剂四：液体×1瓶，4℃避光保存，未变成蓝绿色之前均可使用。

标准品：液体×1支（EP管中），2 μmol/mL酚标准液，4℃保存。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，4℃、8000g离心10min，取上清液待测。

2. 细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 血液可直接测定，或者适当稀释后测定。

测定步骤：

1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到510 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂三置于37℃水浴中预热30 min。

3. 空白管：取EP管，加入4μL蒸馏水，40μL试剂二，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四120μL，混匀后于510nm测定吸光度，记为A空白管。

4. 标准管：取EP管，加入4μL标准品，40μL试剂二，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四120μL，混匀后于510nm测定吸光度，记为A标准管。

5. 对照管：取EP管，加入4μL上清液，40μL蒸馏水，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四120μL，混匀后于510nm测定吸光度，记为A测定管。

6. 测定管：取EP管，加入4μL上清液，40μL试剂二，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四120μL，混匀后于510nm测定吸光度，记为A测定管。

其中标准管和空白管只需做一管，测定管和对照管每个样均需做。

注意：空白管和标准管只需测定一次。

AKP/ALP活性计算：

1. 血液中AKP/ALP活力计算

活性单位定义：37℃中每毫升血液每分钟催化产生1μmol酚定义为1个酶活单位。

AKP/ALP活力(μmol/min /mL)= [C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总] ÷V样÷T=6.8×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)

2. 组织、细菌或细胞中AKP/ALP活性计算

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1 μ mol酚定义为1个酶活单位。

AKP/ALP(μmol/min/mg prot)=[C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总]÷(Cpr×V样)÷T=6.8×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管) ÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：37℃中每克组织每分钟催化产生1 μ mol酚定义为1个酶活单位。

AKP/ALP(μmol/min/g 鲜重)=[C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T=6.8×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管) ÷W

（3）按照细菌或细胞数量计算

活性单位定义：37℃中每10⁴个细菌或细胞每分钟催化产生1 μ mol酚定义为1个酶活单位。AKP/ALP (μmol/min/10⁴ cell)= [C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T= 6.8×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管) ÷细胞数量

C标准品：2μmol/mL；V反总：反应体系总体积（mL），205μL=0.205mL； Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司生产的BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），0.004mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间（min），15 min。

注意事项：

1.试剂二、试剂三和试剂四均需避光保存。

2.试剂四变蓝绿色后不能再使用。

3.加入试剂四后必须立即混匀，否则显色不完全。