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ADPG焦磷酸化酶(AGP)检测试剂盒

BH-9611208
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腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylaseAGP活性测定试剂盒说明书

                                   微量法 100/96

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中,催化葡萄糖-1-磷酸与ATP反应生成淀粉合成的直接前体ADPG,是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。

测定原理:

AGP催化的逆向反应生成G1P,在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH340nm下测定NADPH增加速率,即可计算AGP活性。

自备仪器和样品:

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰蒸馏水

试剂的组成和配制

提取液液体100mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体20mL×1瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1瓶4℃保存;临用前加入9mL蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融

试剂:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用加入4mL蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融

粗酶液制备 

按照组织质量(g:提取液体积(mL)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2、试剂一置30℃保温10min以上。

3、在EP管中按顺序加入下列试剂

试剂名称μL

测定管

试剂一

50

试剂二

80

样本

10

混匀,30℃保温15 min,置沸水浴中1 min(盖紧,防止水分散失),冰浴迅速冷却后,4000g4℃离心5min,取上清液,在96孔板中依次加入下列试剂

上清液

80

试剂一

85

试剂

35

混匀后,立即于340 nm波长下记录初始吸光度A1 2min后的吸光度A2,计算ΔA=A2-A1

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylaseAGP活性测定试剂盒说明书AGP活性计算

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

1、按样本蛋白蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活性单位。

AGPnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T×稀释倍数

                =2813×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按照样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

AGPnmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d×109W× V÷V样总)÷T×稀释倍数

                =2813×ΔA÷W

V反总:反应体系总体积,2×10-4 LεNADPH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光径,1cmV样:加入样本体积,0.01mLV样总:加入提取液体积,1 mLT:反应时间,2 min;稀释倍数:1.75Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量。

b.使用96孔板测定的计算公式如下:

1、按样本蛋白蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活性单位。

AGPnmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T×稀释倍数

                =5627×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按照样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

AGPnmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d×109W ×V÷V样总)÷T×稀释倍数

                =5627×ΔA÷W

V反总:反应体系总体积,2×10-4 LεNADPH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cmd96孔板光径,0.5cmV样:加入样本体积,0.01 mLV样总:加入提取液体积,1 mLT:反应时间,2 min;稀释倍数:1.75Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量。

 

 

 

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