H2S含量测定试剂盒说明书
微量法100T/96S
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
H2S是一种新型气态信号分子,存在于脑内的神经递质,生理浓度的H2S对神经系统海马的长时程增强功能具有重要的调节作用,并对自发性高血压、出血性休克及肝硬化等疾病的过程发挥着重要的病理生理效应。
测定原理:
H2S与醋酸锌、N, N-二甲基对苯二胺和硫酸铁铵等反应生成亚甲基蓝,亚甲基蓝在665nm处有最大吸收峰,通过测定其吸光值可计算H2S含量。
自备仪器和样品:
天平、低温离心机、酶标仪、96孔板、蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体25mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体16mL×1瓶,4℃保存。
试剂三:液体8mL×1瓶,4℃避光保存。
试剂四:液体8mL×1瓶,4℃保存。
试剂五:液体1.5mL×1管,4℃避光保存。
样品处理:
1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后10000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
3. 血清(浆):直接测定。
操作表:
1、 酶标仪预热30min,调节波长至665nm。
2、 操作表
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空白管
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测定管
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样品(μL)
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150
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H2O(μL)
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150
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试剂一(μL)
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150
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150
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充分震荡混匀
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试剂二(μL)
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150
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150
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10000g,4℃,离心10min,去上清,留沉淀
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H2O(μL)
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150
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150
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10000g,4℃,离心10min,去上清,留沉淀
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试剂一(μL)
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75
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75
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试剂三(μL)
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75
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75
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充分震荡混匀
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试剂四(μL)
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75
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75
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10000rpm,4℃,离心10min,吸取200μL上清于96孔板中
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试剂五(μL)
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10
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10
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混匀,25℃静置5min,测定665nm吸光值,记为A测定和A空白,ΔA=A测定-A空白。
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H2S含量测定试剂盒说明书计算公式:
用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线回归方程为:y = 0.0022x,R2 = 0.9988
(1)组织样品
a.按照蛋白浓度计算
H2S(nmol/mg prot)=×V反总÷(V样×Cpr)=681.8×ΔA÷Cpr
b.按照样本重量计算
H2S(nmol/g 鲜重)=×V反总÷(V样÷V样总×W)= 681.8×ΔA÷W
(3) 细胞
H2S(nmol/104 cell)=×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量(万个))=681.8×ΔA÷细胞数量(万个)
(2)液体样品H2S(nmol/mL)=×V反总÷V样= 681.8×ΔA
V反总:反应总体积,0.225mL;V样:反应中样品体积,0.15mL;V样总:加入提取液体积,1mL;W:样品质量,g;Cpr:蛋白浓度,mg/mL
注意事项
最低检出限为1nmol/mL。