公司产品仅科研研究使用，不得用于临床诊断！
肺炎克雷伯菌khe基因探针法荧光定量PCR试剂盒【预期用途】
本产品是根据探针法荧光定量PCR原理开发的肺炎克雷伯菌khe基因检测试剂盒。
【检验原理】
本试剂盒可用于检测肺炎克雷伯菌的khe基因。肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae）俗称肺炎杆菌，为革兰氏阴性杆菌，常存在于人体上呼吸道和肠道，当机体抵抗力降低时，便经呼吸道进入肺内而引起大叶或小叶融合性实变，是肠杆菌科克雷伯菌属中对人致病性较强的重要条件致病菌和医源性感染菌。在院内感染的败血症中，克雷白杆菌以及绿脓杆菌和沙雷菌等均为重要病原菌，病死率较高。Khe基因是肺炎克雷伯菌的特征性基因，仅存在于肺炎克雷伯菌 。
【试剂组成】
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名 称
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规 格
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2 × Probe qPCR Mix
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550uL×1管
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DEPC-H2O
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1mL×1 管
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荧光模板稀释液
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1mL×1 管
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肺炎克雷伯菌 khe qPCR 引物-探针混合液
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260uL×1 管
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肺炎克雷伯菌 khe qPCR 阳性对照
(1.00E+08 拷贝/μL)
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50uL ×1 管
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说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
鸡毒支原体探针法荧光定量PCR试剂盒
【运输及保存】
低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。阳性对照需要单独放置，不要污染其他试剂。
【使用方法】
一、DNA提取(样本制备区)
用自选方法提取纯化样品DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。
二、稀释标准曲线样品(样本制备区)
（由于阳性对照浓度高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，避免污染样品或本试剂盒的其他成分）。
1. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光模板稀释液，（最好用带芯枪头，下同）。
3. 在7号管中加入5μL1.00E+08拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1.00E+07拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在6号管中加入5μL1.00E+07拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1.00E+06拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在5号管中加入5μL1.00E+06拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1.00E+05拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
若无需制作标准曲线，将阳性对照稀释到1.00E+05拷贝/μL即可。
三、试剂配制(试剂准备区)
准备足量的qPCR管(样品管、阴性对照管、阳性对照管)，向各qPCR管中分别加入下列成分：
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成分
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N个
待检样品管
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qPCR
阴性对照
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qPCR
阳性对照
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2 × Probe qPCR Mix
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各10μL
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10μL
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10μL
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肺炎克雷伯菌 khe qPCR 引物-探针混合液
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各5μL
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5μL
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5μL
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转移至模板添加区。
四、添加模板(模板添加区)
向qPCR管中分别加入5μL模板，顺序为阴性对照（DEPC-H2O）、待测样品模板、肺炎克雷伯菌kheqPCR阳性对照，离心30秒，立即进行扩增反应。
将qPCR管放置在qPCR扩增仪器样品槽相应位置，进行扩增，扩增程序如下：
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过程
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温度
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时间
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预变性
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95℃
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3min
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qPCR反应
（45个循环）
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95℃
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15sec
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60℃
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60sec
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信号通道
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FAM通道采集荧光信号
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1. 如果制作标准曲线，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，推算出其浓度。
2. 如果未制作标准曲线，按照如下标准判定结果：
阳性对照（1.00E+05拷贝/μL）结果：Ct值<30，有明显指数增长，呈典型的S型曲线。
阴性对照结果：Ct值>40或无Ct值，无明显指数增长期和平台期。
样本检测结果：Ct值<38，有明显指数增长，表明样本中检测出肺炎克雷伯菌khe，结果为阳性；Ct值>40或无Ct值，表明样本中未检测出肺炎克雷伯菌khe，结果为阴性；Ct值在38-40范围，应对样本进行复检，如重复实验结果Ct值仍在38-40范围，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。
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