说实话，刚入行那会儿，我也对着PCR试剂盒发过呆。
彼时觉得, 这东西难道不就是个所谓的“小盒子”, 将样本往里面一扔, 那机器开启运作, 相应结果便随之呈现出来了, 恰似运用微波炉去热剩饭菜那般, 能算得上有多大的事情。
后来被现实狠狠抽了一巴掌。
曾有一回实验, 针对同一批样本, 更换了试剂盒的牌子, 然而结果却全然对不上。那时我整个人一下子就懵了, 面对着两条截然不同的扩增曲线, 脑海当中仅仅有一个想法: 究竟哪一个才是准确的呢?
从那以后，我再也不敢小看任何一个PCR试剂盒。
为什么PCR试剂盒会“翻车”？
你或许也碰到过这般状况, 明明是严格依照说明书去操作的, 保存的温度并未超出规定范围, 有效期也还未过, 然而最终的结果却并非是正常的, 要么是Ct值飘移得十分离谱, 要么就是干脆根本没有扩增出来。
我并非从事研发工作之人, 没得以给你讲解那些繁杂的引物设计原理。然而历经这些年的摸爬滚打之后, 我归纳出一条极为朴实的规律: PCR试剂盒这一物品, 如同人一般, 越是“娇气”的便越易于出现问题。
为样本质量设定极高要求的盒子, 一旦血液样本出现些许溶血情况, 便会开始表现出异常。对于对操作手法有着特殊敏感性。在加样过程中, 若手抖了一下从而多吸了0.5微升, 那么整条曲线就会出现偏离正常的状况。
所以，别再问“这个PCR试剂盒准不准”这种傻问题了。
你应该问的是：“它在我现有的条件下，能不能稳定地准？”
PCR试剂盒的核心秘密：别信广告，信“复孔”
我见识过好多好多人, 在购买试剂盒以前, 把那宣传册翻得都快烂掉了, 诸如“灵敏度99.9%”“特异性100%”这些内容, 看得内心热血都沸腾起来了。等把试剂盒买回来试用之后, 哎, 发觉效果的确还算可以。
但问题是，你做过复孔吗？
做过十次以上的重复实验吗？
在极端低浓度样本下测试过吗？
那些真正称得上行家的人, 从来都不会去瞧宣传册里呈现的那些看似诱人的漂亮数字。当他们拿到一个全新的PCR试剂盒时, 会去做三件事情: 其一, 进行梯度稀释操作, 以此来查看线性状况是否良好；其二, 在不同批次的样本之上反复地进行试验；其三, 找一个自己内心信任的老盒子来做平行对比。
只有这三关都过了，他们才会点头说：嗯，这个盒子，靠谱。
存放不当，再好的PCR试剂盒也白搭
针对这一点, 我是必须要好好地阐述一番的。有相当多的人认为PCR试剂盒是具备很强抗耐受能力的, 然而实际情况呢, 并非如此。
它是真的怕热、怕反复冻融、怕光、怕一切让它不舒服的环境。
我曾见识过一个实验室, 为图省事, 将PCR试剂盒的大包装拆解开, 没用完的酶直接置于4°C, 心里琢磨着“后续隔天还要用呢”。结果次日所做出的结果, 糟糕到不忍直视。而后才发觉, 那般酶于4°C放置了一整夜, 活性已然下降相当大的幅度。
因此, 请牢记这一微小的知识要点: PCR试剂盒当中的关键构成部分, 特别是聚合酶, 是极具脆弱性的。哪怕你仅仅是将其从零下二十摄氏度取出, 在室温环境下多放置了五分钟, 它都会对你心生“怨恨”, 进而在实验结果方面对实行报复。
怎么选一个靠谱的PCR试剂盒？
对于这个问题而言, 它实在是颇为复杂, 以至于在当下的状况下, 我根本就没有办法能够给予你一个堪称标准的答案。这是由于, 针对不同的检测目标来讲, 所需要的试剂盒却是全然不一样的。就像进行病毒检测的时候, 所使用的和进行基因分型时所运用的, 那根本就不是同一种东西。
但我可以给你一个避坑的方法：
别单单只把目光聚焦在大牌之上, 大牌的PCR试剂盒的确是稳定的, 然而其价格那也是“稳定”到了让人心生疼惜之感的地步呢 , 许多小厂所生产的盒子, 实际上做得相当不错, 只不过是名气没有那么大罢了 , 那要如何去进行判断呢 , 去询问那些用过的同行呀 , 在实验室这个圈子内部, 口碑比起广告来可是要管用一万倍的。
并且, 去查看说明书。一份相当不错的说明书, 会将引物序列、探针序列以及反应体系的优化进程都书写得明明白白。那种遮遮掩掩、关键信息模模糊糊的PCR试剂盒, 直接予以摒弃。
最后说点实在的
PCR试剂盒这东西，说白了就是一个工具。
工具能发挥多大作用，从来不取决于工具本身，而在于用它的人。
你的操作遵循规范, 样本处理妥善, 仪器校准精准无误, 哪怕运用一个中规中矩的试剂盒, 也能够获取漂亮出众的结果。你在各个环节全然漏洞百出, 即便使用最为顶级的盒子, 该是会出现翻车状况仍旧会发生翻车 的。
因此, 不要将全部希望都寄托于PCR试剂盒之上。要多多锻炼自身的手, 要多多钻研实验流程, 这才是真正能够使你在实验室中立足脚跟的事物。
写这篇文章的时候，我杯子里的咖啡又凉了。
算了, 不再喝了。下一轮的实验, 还需要继续开展。新到货的PCR试剂盒, 又得重新去验证一遍了。
实验室的日子，就是这么琐碎、重复，又他妈的真实。
