有时, 我真切地感觉, 实验室中的那台荧光定量PCR, 好似一位带有脾性的艺术家。
你摸不透它，又离不开它。
提及此事, 这物品已非新鲜之物, 从事相关研究的人哪个未曾经历过数台? 然而倘若你切实问上一句——它究竟是否精准? 众多人便会表现得吞吞吐吐。并非对此不了解, 而是不敢明确断言。
毕竟科学这回事，讲究一个“概率”。
然而, 今天我反而就要讲, 讲的时候力求直白一些, 反正啊不存在有人给我支付薪酬, 还惧怕什么。
荧光定量PCR到底准不准？
先给你讲个真事。
前一个月的时候, 有一位从事做检测工作的朋友, 手里握着好多数据来到我这儿。他满脸愁容, 讲的是同样一个样本进行了两次检测, Ct值之间相差了1.5。他满心疑惑, 不知道究竟该相信其中的哪一次结果。
我说，你信第三次。
他呆住了, 我讲, 并非开玩笑, 荧光PCR这类事物, 误差原本就在那里放置着, 你所能做的并非消除误差, 而是把控它。
之后, 他更换了一批试剂, 再次进行了三遍重复操作, Ct值稳定在了0.3以内, 他这才舒缓了一口气。
所以你说它准不准？准，但有个前提——你得伺候好它。
为啥同样的样本结果不一样
我见识过数目众多的人, 刚一开始就发起怨言, 说仪器不准确、试剂不达标。实际上好些时候, 问题是出在你自身之上的。
比如提取环节。
均为提核酸之举, 然有人借助手来提, 有人运用磁珠提, 有人依靠柱子提。每一步骤的效率皆存在差异, 最终上机时的模板量会相差数倍之多。模板量有所不同, 那 Ct 值能够保持一样吗?
而且存在引物探针, 有些人在完成设计之后, 并未对特异性予以验证, 就直接去下单进行合成, 结果当放到机器上查看的时候, 发现非特异扩增数量众多, 背景高得足以令人感到惊恐, 你说这样能够准确吗?
接着便是反应体系, 在加样之时, 曾出现手抖那么一下的情况, 枪头未曾完全排净, 气泡也没有彻底弹掉落, 诸如此类的小毛病积攒起来, 最终的数据也就不用去提及了。
所以别急着怪机器，先问问自己：每一步都做到位了吗？
内参基因到底选哪个
这问题我被人问过不下五十次。
挑选内参基因, 并非越昂贵就越好, 也并非越常见就越好, 而是要看你所做的样本, 以及处理的条件状况下, 哪一个基因的表达最为稳定。
有这么一个人, 在进行细胞实验时, 整个过程全都使用GAPDH, 然而在给予药物刺激之后, GAPDH竟然发生了变化, 可他却依然将其用作内参, 这样的数据, 你会相信吗?
通常情况下我会给出这样的建议, 在条件合乎要求准许的情形下了的时候, 首先去开展进行一次预实验, 对几个候选的内参来测量其表达的稳定性。真要是条件实在不允许没办法达成的话, 则运用使用geNorm或者NormFinder这些工具来进行计算得出结果。千万别想着偷懒, 这种懒是绝对偷不得不可以偷的。
扩增效率多少才算正常
又是一个容易让人踩坑的点。
把理想的扩增效率设定在90%至110%这间视为合理。然而要是你跑到隔壁那间实验室去询问里面的人, 那么他有可能会告知你, 他每一回都能够把扩增效率达成在99%以上。
别信。
那一情况是他对参数予以了调整, 对数据施行过筛选。实际当中真实存在的实验, 其扩增效率能够稳定处于95%至105%这个范围之间, 便已然是相当良好不错的了。
你非要追求百分百完美，反而可能适得其反。
标准曲线怎么做才靠谱
做标准曲线，最怕的就是偷工减料。
有的人只是进行三个点的操作, 而且这三个点全部都是按照10倍的梯度来加以稀释的, 其结果呈现出来的线性关系看样子是挺好的, 然而实际上所存在的定量误差却大得实在是离谱。
至少五个点，每个点三个重复。这是底线。
另外, 稀释液是需要去更换的。不要用诸如水、TE这类东西来进行糊弄。血清相匹配的稀释液, 或者基质相匹配的稀释液, 才是符合要求的。
我曾有过犯懒之举, 采用纯水对一套标准品予以稀释, 而后跑测定得到R方为0.999, 那时高兴到了极点。然而将其拿去对未知样本进行定量时, 误差却直接成倍增加。直至后来才了解到, 水里含有的离子以及pH值, 均会对扩增形成影响。
教训啊。
溶解曲线看了吗
许多从事荧光定量PCR操作的人, 仅仅将目光聚焦于Ct值, 连溶解曲线都未曾看一眼, 就结束了操作。
你以为扩增出来的都是目标产物？想得美。
引物二聚体, 会产生荧光信号, 会拉高“阳性”判断。非特异性扩增, 会产生荧光信号, 会拉高“阳性”判断。基因组DNA污染, 会产生荧光信号, 会拉高“阳性”判断。
所以，扫一下溶解曲线吧。三五分钟的事，能救你于水火。
重复性差怎么办
重复性差，先别急着砸仪器。
瞧瞧操作的流程, 是不是具备标准化的特性? 瞅瞅加样的手法, 是不是呈现统一的状态? 看看每一回所运用的试剂, 是不是属于同一批次?
有些时候, 问题极为简易, 然而存在的情况却是, 有人在运用枪的时候, 并未事先为之进行润洗操作, 进而致使加样的量不准确, 像这般的状况, 你觉得能够进行重复吗? 句号。
还有一点容易被忽视: 热盖的温度, 热盖温度要是过高, 反应液便会蒸发, 体积随之变小, 荧光信号就会出现漂移, 热盖温度要是过低, 冷凝水就会产生, 同样会造成影响。
所以，细节决定成败，这话在荧光定量PCR里，一点都不虚。
说点扎心的
实际上, 好多人没法把荧光定量PCR做好, 并非是技术方面存在欠缺, 而是心态出现了问题。
太着急出结果了。
样本尚未妥善提取就匆忙跑开, 跑出来的数据状况不佳便急忙更改条件, 更改条件之后又不进行验证。最终数据杂乱无章, 还归咎于仪器不佳。
我要告诉你, 这仪器尽管属于机器范畴, 然而它具备着如同人一般的性子。你必须依照它的特性, 顺着它的心意, 哄着它的脾气，理解它的行为模式。
你理解了它，它才会给你好数据。
最后
荧光定量PCR这东西，说到底就是个体力活。
你于前处理方面投入的精力有多少, 于质控环节付出的精力是何等状况, 于验证之时投入的精力怎样, 它就向你返还多少等同于准确度的成果。不存在捷径, 也不存在魔法。
但好消息是，只要你认真对待每一步，它真的不会让你失望。
至少，我还没见过认真做的人，拿不到可靠数据的。
