讲实在的，最初开始接触PCR试剂盒之际, 我觉得这东西全都没啥差别之分。
就只是把模板、引物、酶、dNTP这些混合到一块儿, 让机器运行一番从而得出一条曲线这么个事儿。然而呢, 出现了三次失败, 耗费了一周时间, 还被导师数落得很惨很惨, 这才知晓其中的门道有多复杂。
有可能你也碰到过这样的状况: 新购买的试剂盒呢, 依照说明书一步一步严格去做，然而最终跑出来的结果却是, 要么没有出现扩增的情况, 要么尽是一堆呈现非特异性的条带, 要么Ct值高到了极其离谱的程度。
你以为是自己的手出了问题，其实可能是试剂盒本身就有问题。
PCR试剂盒到底是个什么东西
简洁直白来讲, PCR试剂盒乃是将进行PCR所需的全部“配料”予以整合打包进而形成的一整套物品, 你无需自行去配制缓冲液, 无需单独购置 enzymes, 但并不去操心Mg2+浓度这类繁杂多样的参数, 只需径直加入你的样品以及水就可以了。
是不是听起来挺省事, 对吧? 然而问题在于, 市面上的PCR试剂盒数量众多, 价格便宜的二三十块钱一盒, 价格贵的则有一两百, 其参数看上去都相差无几, 可实际效果却有着极大的差异, 相差甚远。
有一回, 我出于节省预算的目的, 购置了一个杂牌的所谓“高性价比”试剂盒。在要去进行做定量PCR操作的时候, 出现了重复孔的Ct值相差整整1.5这种情况。1.5啊, 各位兄弟们, 而这在定量实验当中基本上就等同于废掉了。
省钱省出来的不是预算，是返工的时间和崩溃的心态。
你的样品类型决定你该选什么试剂盒
好多人一开始就问“哪个PCR试剂盒最佳”, 此问题实际上没办法作出回答, 由于不一样的样品, 适用的试剂盒全然不相同。
你所进行的是血液样本相关操作? 那么你需要考虑的是是否存在抑制物, 要挑选那种抗抑制能力强大的。
倘若你所进行操作的是FFPE样本, 那么你必须挑选那种专门针对降解DNA予以设计的, 普通的试剂盒其扩增效率将会十分低下。
你所做的是环境方面的样本 , 土壤之中、水样里面的那些杂质 , 普通的试剂盒根本承受不了。
我存在一位友人, 其从事污水检测工作, 运用普通试剂盒开展各类检测时, 遭遇多种失败情况, 后来更换了一款专门针对于环境样本的试剂盒, 仅尝试一次便大功告成。他声称, 先前那些失败的实验, 好似借助菜刀去拆卸螺丝, 工具使用不当, 即便付出再多努力, 亦是毫无成效可言。
所以，别问哪个最好，先问你的样本是什么。
灵敏度高不代表一切
我得承认, 往昔我也曾迷信“灵敏度越高便越好”这般说法, 觉着能够检测到低拷贝数的样本那便是厉害, 就是特别厉害。
但是, 后来察觉到, 那些灵敏度比较高的试剂盒, 常常会伴随有一个问题, 那就是, 容易出现假阳性的情况。
为何会这样? 乃是由于灵敏度过高所致, 即便在实验室环境当中仅有极为微小的一点点气溶胶污染存在, 又或者在加样期间不经意间碰到了一下管壁, 都能够为你实现扩增。其结果便是, 阴性质控毫无缘由地出现了曲线, 于是你开始对人生产生怀疑, 思忖是不是自身的操作存在问题, 寻思是不是超净台遭受了污染。
高灵敏度是一把双刃剑，你hold不住，就别玩那么极限的。
目前我所采取的做法是, 依据实验的目的进行选择。要是我的样本浓度原本就偏高, 就像在进行转基因检测的时候, 选用中灵敏度的试剂盒便已足够, 并且稳定性反倒更佳。唯有那种痕量检测的情况, 诸如法医鉴定、早期病原体筛查之类, 才需要采用高灵敏度的。
荧光检测通道和仪器兼容性，这个问题很多人忽略
我曾目睹有人购入某一品牌试剂盒后, 将其置于自己的实验室的用于定量分析的PCR仪器上进行操作, 然而却发觉荧光信号极为微弱, 即便对各类参数予以调节亦是毫无成效。
之后去询问, 这才晓得那个试剂盒的荧光染料跟仪器的检测通道并不匹配, 举例来说, 试剂盒所采用的是FAM通道的探针, 然而你的仪器该通道的激发效率并不高, 又或者滤光片存在问题, 最终信号就变得很不理想了。
这个问题真的很常见，尤其是跨品牌混搭的时候。
买之前一定要查清楚：你的仪器型号，你选的试剂盒，到底匹不匹配。
存在一些试剂盒, 它们特别适配某几个品牌, 像是ABI、Bio-Rad、Roche这些之类的。倘若你所使用的是小众仪器, 那么最好先询问技术支撑, 而不要凭借感觉去下单。
热启动酶和普通酶，时间允许的话，选热启动的
热启动酶价钱高, 然而它具备相应价值。原因何在呢? 这是由于热启动酶于低温环境下不存在活性, 唯有在高温导致变性之际才会被激活。如此一来便规避了在配制反应液乃至预变性阶段出现引物二聚体以及非特异性扩增的情况。
拥有这般功能的并非普通的酶, 而你于加样之际让其于室温所处时长过久, 致使它开始出现“乱动”的状况, 最终跑出来的条带呈现出杂乱无章的态势。
我自身个人所拥有的经验便是, 若不是你处于特别着急赶时间的状况, 以及预算是极其紧张的情形, 否则只要能够选择热启动的, 那就尽量去进行热启动的选择。
多花几十块钱，省去后面做条带回收、测序验证的痛苦，这笔账怎么算都划算。
关于保存和运输，不要小看
你所购置的PCR试剂盒, 不少是需在-20℃环境下保存的。然而关键的问题是, 从生产厂家起始, 经由代理商环节, 最终抵达你手中, 这一过程之中的冷链运输是否具备可靠性呢?
夏天的某一次, 我所购买的试剂盒送达之际, 其中的冰袋已然化为水状, 试剂盒触摸起来呈现温热之感。彼时我觉得大概不会有问题吧, 于是便将其放回冰箱。然而后续使用之时, 酶的活性显著降低, 扩增效率大幅变低了。
所以，到货后第一时间检查冷链情况，如果温度没达标，果断退换。
并且, 存在一些试剂盒能够在4℃的条件下将其进行短期的保存, 然而要是长时间放置的话绝对是会出现失活的情况的。记得不要去大量囤积物品, 要根据需求来采购。
PCR试剂盒的选择这件事, 往根基上说就是这么一个情况: 不要仅仅去看价格, 而且不要仅仅参照参数, 而是得去审视你的实验所需。
把你所做的实验类型, 以及你的样本, 还有你的仪器, 再加上你的预算, 连同你的操作习惯, 这些因素全部加起来, 才能够帮你找到最为合适的那一个。
许多回我都遭遇翻车状况, 耗费了大量金钱以及时间, 如此这般反复多次, 才逐渐摸索明晰这般些门道。期望上面所提及之经验, 能够助力你减少些许弯路。
毕竟，实验已经够难了，别让试剂盒再给你添堵。
