荧光定量PCR，这个名字听着挺唬人的。
第一次我接触之际, 脑袋里尽是问号, 这是啥玩意儿呀, 荧光之外还有PCR。
其实就是个放大镜。放大DNA的。
这玩意儿到底是干嘛用的？
在新闻当中, 你或许听闻过这个词汇, 在疫情那段时期, 它每天都会被提及。实际上, 它是一种检测工具, 是专门用于寻觅特定DNA片段的。
如果你想晓得某个样本之中是否存在新冠病毒的RNA, 运用这个便能够检测出来。关于原理, 先是将你样本里头的RNA反转成为DNA, 随之进行疯狂复制。每复制一回算作一次, 荧光信号就会强化, 由机器记录下来, 最终算出一个Ct值。
Ct值越低，说明样本里病毒越多。
切勿匆忙离开, 此物品应用极为广泛。食品当中是否含有转基因成分? 通过查询即可知晓。血库里面是否存在乙肝病毒? 同样能够进行检测。在科研领域用于测基因表达量, 依旧会使用到它。
荧光定量PCR和普通PCR有啥区别？
普通PCR属于那种极为简单易操作像是傻瓜都会用的工具, 仅仅能够告知你“存在着”或者“不存在着”。比如说, 当你完成了反应之后, 去跑一次胶, 瞧瞧是不是有一条条带, 要是有那就表明是有的, 要是没有那就证明确实没有。
荧光定量PCR不一样，它能告诉你有多少。
这便是定量所蕴含的意义, 对整个反应进程进行实时监测, 每当进行一轮复制, 荧光便会更亮一些, 机器自始至终全程密切注视, 最终为你绘制出一条曲线图, 清晰明了地向你告知初始模板量究竟是多少。
那就仿佛, 那种普通的PCR, 仅仅能够告知你, 菜里头是存在盐的, 然而荧光定量PCR, 却能够告诉你, 盐到底是放了5克, 还是放了10克。
差别大了去了。
新手最容易搞混的两件事
第一个，Ct值不是浓度。
不少人觉得Ct值低就等同于浓度低, 这是不对的。Ct值越小, 表明模板被检测到的时间越早, 意味着初始模板浓度越高。Ct=15的样本和Ct=30的样本相比, 病毒数量多了好几十倍。
第二个，扩增效率很重要。
无论你所购入的标准品, 还是自行研制的标准曲线, 其扩增效率最优范围处于百分之九十至百分之百十之间, 百分之九十以下意味着反应条件存在问题, 百分之百十以上则或许存在非特异性的扩增情况。
当我处于进行实验的那个阶段时, 标准曲线的斜率始终呈现出不正确的状况, 而后经过一番探寻才发觉原来是引物的设计方面存在着问题, 在更换了引物之后一下子就恢复正常了。
为什么会出现扩增失败？
这个问题我问过八百遍。
最为常见的缘由是: 引物存在问题。或者是设计方面存有差错, 又或者是发生了降解现象。另外还有一种可能性, 那就是模板当中含有抑制剂, 像血液样本里的血红蛋白这种物质, 它会对酶的活性起到抑制作用。
解决办法也简单：重新设计引物，或者纯化模板。
再一个常常能见到缘故: 退火的温度并非正确的那个。每一组引物均存有最优的退火温度, 相差个二度便有可能无法扩增出来。去尝试实施梯度PCR操作, 寻觅适宜的最为恰当的温度。
我用这招救回过好几次失败的实验。
荧光染料和探针怎么选？
这个选择挺多的。
极为简单的, SYBR Green, 价格低廉, 具备通用性。任何引物均可使用, 通过做溶解曲线便能够判断特异性。不足之处在于极易沾染脏污之物, 实施非特异性扩增同样会产生信号。
TAQMAN探针, 价格较贵, 然而特异性程度颇高。唯有探针序列与目标片段相匹配, 方可产生信号, 非特异性扩增并不会造成干扰。其适宜用于多重检测, 能够一次对好几个靶标进行检测。
针对新手而言, 建议刚开始先运用SYBR Green来进行练手操作, 其具有价格低廉的特点, 并且所产生的数据也能够清晰地予以分析, 待熟练掌握之后再去使用探针。
依据我个人所拥有的经验, 进行表达量分析的时候采用SYBR Green就可以, 而开展病原体检测则最好运用探针, 因其具备稳定性。
Ct值多少算正常？
这个没标准答案，得看你的样本和实验目的。
Ct值处于15至35之间时相对可靠一些, 可以这样说, 要是小于15的话呀, 那就表明模板浓度过高呢说不定得给他稀释一下才行, 而要是大于35的状况下，信号非常 feeble ，存在两种假设情形, 其一可能是假阳性, 其二也有可能是模板的含量特别特别低。
进行临床检测时, 通常情况下, Ct值大于35便会判定为阴性。在科研领域当中, 能够放宽至40, 不过需要进行重复操作。
我所见识到的最为夸张的情况是, Ct值竟然达到了数四十八, 然而却依旧声称是呈阳性, 这明显无疑就是在玩弄数字方面的奇特游戏。
实验步骤到底怎么做？
简单说几步：
第一步，提取核酸。不管是DNA还是RNA，纯度高最重要。
接下来的第二步, 是要去配制反应体系, 将模板、引物、酶以及荧光染料这些东西混合在一起, 要注意整个过程不要产生气泡, 因为气泡会切实影响荧光读取工作的准确性。
到了第三步, 要去上机操作, 将程序设定妥当, 进行95度的变性处理, 接着开展60度的退火延伸操作, 随后重复40至45个循环。
第四步, 对数据展开分析，查看Ct值, 观测扩增曲线, 审视溶解曲线, 进而判别结果是不是可靠。
做此实验之际最为让人感觉到崩溃不已的究竟是什么呢, 那便是在进行配体系这个操作之时, 手部不经意间抖动不停, 从而致使样被加错, 进而整块板子完全报废了。
于是乎我始终都在给出建议, 调配体系之际开枪得要稳健, 添加样本的时候速度得要缓慢, 更换枪头需要勤快些。宁愿速度慢些, 也别出现失误。
怎么能让数据好看点？
这个很多人关心。
首先, 要保证内参处于稳定状态。在进行表达量分析时, 如果内参选取不当, 那么后续的工作将全部徒劳无功。常用的内参有GAPDH、Actin等, 然而不同组织中这些内参的表达量存在差异, 所以需要自行去验证。
样本需进行重复操作, 最优为三个重复, 最少也要有两个重复, 数据选取并求取平均值, 据此查看变异系数。若CV值超出0.5%的情况, 那就必须重新进行操作。
阴性对照是一定要做的, 不加模板的对照管一旦出现信号, 那就表明试剂受到了污染, 如此一来结果就全都废掉了。
我存在一位同事, 其进行了为期半个月的荧光定量PCR操作, 然而数据始终未呈现正确状态, 最终结果表明是水中具备气溶胶污染情况, 更换为全新的水之后局面得以改善。
结尾说点啥
荧光定量PCR就是个工具，说难也不难，说简单也不简单。
处于关键地位的乃是细节所在, 引物的设计, 反应的条件, 模板的质量, 数据的分析, 每一个步骤都绝对不可以有丝毫的疏漏。
你只要做几次，摸索出窍门，后面就顺手了。
别怕失败，那个跑出漂亮扩增曲线的瞬间，你会觉得一切都值了。
