养兔原代细胞这事吧，说起来简单。
可是一旦真正亲身去操作, 哪一个不是满心的辛酸泪水。在实验室里度过的那些熬夜时光, 还有接连养死掉的细胞, 堆积起来的话能够环绕培养箱三圈。
刚开始接触兔原代细胞的那个时候, 我心想着自己可厉害着呢。研究生的三年时间里, 养过好几种细胞系, 有叫HeLa的, 还有293T这种, 就算闭着眼都能去做传代操作。
结果第一次拿到兔原代细胞，直接就懵了。
那玩意儿，跟我们平时养的细胞系，完全是两个物种。
兔原代细胞为什么这么娇气？
不瞒你说，第一个星期我赔进去三批细胞。
向师兄师姐们逐一询问, 他们都说, “原代确实娇贵, 不好养实属正常”。这样的话语听起来真让人心里窝火。凭什么叫做“正常”? 倘若把它养死了算正常, 那么究竟怎样才是不正常?
后来, 我才弄明白, 二者之间的区别, 就好比野生动物与家养宠物有差异那般, 原代细胞和细胞系存在区别。
你先从那个市场里买上一只宠物兔出来, 它打小开始就一直吃着兔粮, 喝着温水, 其性格呢也是温顺的那种。然而要是你从野外去抓一只野兔回来, 它会怕人, 保持着警惕, 饮食方面还特别挑剔, 养不活那实在是太正常不过了。
细胞也是一样的道理。
细胞系于培养皿之中已然传代了成百上千次, 早就对人工环境予以适应。兔原代细胞乃是刚从活体组织里取出的, 其骨子里还留存着“其在体内之时”的那一套生存法则。
大家最常犯的错：把原代当细胞系养
说实话，我第一次失败就是因为这个。
操作时所运用的胰酶, 其消化时长与平常状况保持一致, 所用的培养基乃是实验室里经常会用的DMEM, 且添加了10%的血清。那么最终呈现出的结果究竟如何呢? 细胞贴附于壁面的比率低到了令人惊悚的程度, 死掉的细胞漂浮起来形成了一层。
之后, 向一位在工业领域有着多年原代培养经历的前辈去请教, 他的一句话, 将我点醒, 那就是兔原代细胞并不喜好“标准流程”, 它所需要的是“定制方案”。
比如消化这一步。
兔原代细胞对于胰酶有着极其敏感的特性, 要是你多消化哪怕仅仅十秒钟, 它便会集体出现“罢工”之状。最为妥善的办法乃是将胰酶浓度降低至0.05%, 把时间巧妙控制在1分钟以内, 一边实施消化一边在显微镜下目不转睛地盯着查看, 标点符号。
一旦看到细胞开始变圆、边缘发亮，立马终止。
别等到细胞漂起来再停。到那时候就晚了，细胞膜已经受损了。
培养基选不对，做什么都是浪费
这个问题我踩过坑，真的。
持续在实验室运用普通DMEM, 众人并未察觉到存在什么问题。然而兔原代细胞并非如此, 它对营养要求比细胞系繁杂许多。
有人说“加双倍血清不就行了”。天真。
原代细胞所需求的并非数量, 而是质量。存在着一些生长因子, 包含特定氨基酸, 甚至于微量元素, 普通的培养基之中根本是不足够的。
往后呢, 我变更使用了特地的原发性细胞培养基, 比例做了一下调适, 紧接着细胞的存活率径直提升几乎加倍。
简单说，别省那点钱。培养基这种消耗品，你用对了比什么都强。
传代时机：太早太晚都不行
原代细胞的传代窗口期特别窄。
要是细胞密度没达到70%就进行传代, 它还没有充分生长起来, 这种勉强进行传代的行为就如同是采用杀鸡取卵的方式。
但等到它成长到超过百分之九十之后再去传代, 细胞彼此之间已然相互接触抑制了, 有一些甚至已然开始分化、老化, 在这个时候再去进行传代, 细胞的状态已然回不到原来的样子了。
着实最佳的那个窗口实际上也就仅仅那么大, 大概在80%左右, 能够瞧见细胞相互之间还存有那么一点点的空隙, 然而整体而言已然是完全铺满了。
这个时候消化、分瓶，细胞活力最好。
冻存和复苏，细节决定成败
我见过有人把兔原代细胞当细胞系冻，直接扔-80℃冰箱。
结果复苏的时候，活细胞不到三成。
原代细胞进行冻存时, 必须要使用程序降温盒, 或者直接将其放入液氮之中。而且, 冻存液也需要精心调配, 那种采用普通DMSO加血清的方法, 对于原代细胞来讲太过粗暴了。
存有一种小窍门, 于冻存液之中添加些许抗氧化剂, 诸如维生素E或者谷胱甘肽。原代细胞对于氧化应激是格外敏感的, 在冻存进程里的活性氧会大批量地致使细胞死亡。
加那么一点点，复苏率能提升一大截。
别信那些“万能protocol”
网上搜兔原代细胞的培养方法，能出来几百页结果。
话虽如此老实讲, 大多都是翻来覆去抄的。真正实际有用的信息, 可是你亲自尝试得出的。
兔子存在不同品系, 组织有不同周龄, 细胞又是你的这家公司那边所提供的, 还有一些细胞是从你另外那家购买来的, 然而涉及这些方面的protocol各种情况均不一样。
我现在的做法是：拿到一批新细胞，先做一个小型优化实验。
试一下将胰酶浓度设几个梯度, 试一下把消化时间设几个梯度, 试一下把培养基配方设几个梯度, 甚至试一下把培养箱的CO2浓度设几个梯度 , 每个参数都如此这般试一遍。
看着麻烦，但这才是真正能“养好”原代细胞的唯一办法。
写在最后
养兔原代细胞这事儿，说到底就是三个字：别偷懒。
因其娇气, 故而你需惯着它。因其挑剔, 所以你要顺着它, 它与细胞系有所不同, 于是你得忘却往昔的经验, 再次学成一回。
细胞养好了，实验结果才有说服力。
你花的那些时间、精力、钱，最后都会在数据上还给你。
