搞科研的都懂，细胞株这东西，你越惯着它，它越不听话。
几经周折, 好不容易才构建而成的耐药细胞株, 历时数月精心培养, 却骤然间活性凶猛地急剧暴跌, 甚至有的时候干脆就长成失败难再生, 实验室里一众人员你看看我, 我看看你, 面面上互相窥看向应对难题, 查各种高深繁杂的文献, 换具有不同特性介质, 调理控制其浓度, 一番折腾下来, 却什么问题依旧未能解决。
其实这事吧，没那么玄乎。
为啥耐药细胞株这么难伺候
简单来讲, 耐药细胞株, 其本质是被“逼迫”从而诞生的。你于培养基之中添加药物, 剂量由低向高逐步递增, 那些承受不住的普通细胞全都死亡了, 而存活下来的是能够耐受药物的那一小部分细胞。
但是你仔细去琢磨、思考一下, 这些所谓的“幸存者”, 原本就是依靠着某一种具体特定的机制顽强地硬撑着的, 它们的生存状态可要远远比那些普通的细胞来得更辛苦好多好多。在细胞体内, 代谢通路是被药物持续不断地干扰着的, 而且能量供应从一开始就处于不足的情况, 这个时候, 你要是还用对待普通细胞的那一套常规方法去培育、滋养它, 那它不死亡才怪。
我见识过极为夸张的情形, 存在有人把细胞用带含药性质的培养基去培养, 历经三个月的时间, 然而最终长出来的细胞, 就连进行传代操作都无法达成三代, 全部走向凋亡的状况。往后经过一番查证, 问题所在之处是药物浓度呈现不稳定的态势, 原因是母液搁置的时间太久从而发生了降解, 实际所具备的浓度仅仅只有标注浓度的一半。
怎么判断细胞真的耐药了
很多人的做法是:加药，等几天，看细胞没死，就觉得耐药了。
太天真了。
真正的耐药并非是“不死”这种情况，而是“于药物存在的状况下能够稳定地增殖”这种情形。你需要去做IC50曲线, 以此来对比亲代细胞以及耐药细胞的半数抑制浓度。一般而言, 耐药指数(RI)起码要达到5倍以上, 才算是真正的耐药。
出现了一个容易被人遗忘忽略无视的要点: 耐药细胞株常常通常往往会展现呈现出形态方面的变化。其中有的会转变变得变圆, 有的会生长长出更多的伪足, 有的细胞核会增大变大。当你首次第一次初次看到这些变化之时可能会不禁吓一跳, 误以为是遭受污染了, 然而实际上其实就是耐药之后的适应性改变变化。
养耐药细胞株最常见的坑
药物浓度维持是个老大难
好多人持这样的想法, 觉得只要于培养基里添加药物便可, 然而药物的稳定性存在极大差异, 举例来说, 顺铂在水溶液里易于水解, 阿霉素遇到光容易发生降解, 诸位配好的药液放置一周时间, 或许活性就只剩下一半, 细胞好似处于“低剂量训练”状态, 耐药性便会渐渐退化。
化解的法子并非繁杂: 将药物母液进行小份的分装, 于零下二十摄氏度的环境下避光给予保存, 在使用之前进行现配。含有药物的培养基最好不要超出三天的时长, 要较为频繁地进行更换。
传代时要不要停药
这是个争议点。
有观点称, 停药会致使细胞耐药性丧失, 又有说法是, 不停药细胞状态欠佳。我的经验表明: 低浓度维持才行得通, 可别采用高浓度。诸如平常培养时以IC50的一半浓度予以维持, 实验之前能够适当停药2至3天, 从而让细胞恢复状态, 之后再重新添加药物进行刺激。
虽然存在一些细胞具有特别强的耐受能力, 在停止用药一周之后, 耐药性下降的程度并不显著, 然而对于这种情况就可以比较随便了。
污染问题比普通细胞更麻烦
原本耐药细胞株的状态就欠佳, 极其容易遭受支原体的污染, 并且被污染后表现又不显著, 那些细胞半死不活地维持在那儿, 你误以为是药物毒性致使的, 实际上却是支原体在暗中作祟。
建议每月进行一回支原体检测, 请勿节省费用。一旦真的出现污染, 应立刻着手处理, 切莫存有侥幸心理, 那些看似“顽强”的污染物, 常常比你的耐药细胞耐药性还要强。
构建耐药细胞株的心得
浓度递增法最稳妥
倘若想着一下子就达成目标, 那可不行。有些人妄图省事儿, 便直接采用高浓度, 最终致使细胞全部死亡。而正确的操作方式却是: 首先将起始浓度设定于IC10至IC20这个范围之内, 接着等待细胞能够稳定地进行传代两三次之后, 接下来再去提升浓度。并且每一次提升的幅度不要过大, 50%至100%这样的幅度便足够了。
整个过程可能需要三到六个月，急不来的。
脉冲诱导法适合某些案例
有一些细胞, 针对于持续的药物暴露展现出特别强烈的敏感性, 能运用脉冲诱导法, 也就是以高力度的浓度进行为时较短的时间段处理, 接着撤掉药物以使细胞恢复, 之后再次进行处理, 不断反复形成循环。通过这种方式构建起来的耐药细胞株通常会更稳固, 然而构建所需的周期在时间方面或许会更长。
克隆筛选是王道
即便你构建起了耐药细胞群, 其内部亦是混合而成的群体, 其中一部分耐药性偏高, 另一部分则偏低。若要获取稳定的细胞株, 那就需要采用有限稀释法或者软琼脂克隆的方式, 挑选出单个克隆来进行扩增。
这一步很多人嫌麻烦跳过，结果后续做实验数据漂移得没法看。
到底怎么保存耐药细胞株
冻存这事，说难不难，说简单也不简单。
要点在于, 进行冻存之际, 务必含有药物。细胞于液氮之中, 虽说处于不活动状态, 然而冻存液里的药物, 能够维持针对耐药细胞株的选择压力。待解冻之后, 也别急着将药物撤去, 先运用含药培养基培养两代, 以此使其稳定下来, 然后再对后续实验加以思量。
还有, 冻存时的密度应当稍微提升一些。耐药细胞在解冻之后, 其存活率常常会比普通细胞更低, 要是你冻存的数量过少, 那么就有可能无法复苏成功了。
写到最后
耐药细胞株此物, 说白了乃是一个经人工筛选的进程。你施加给细胞压力, 细胞设法存活下来, 这便是演化。
可是大多数人致使失败的缘由, 并非技术存在欠缺, 乃是缺乏耐心所致。总是一心想着能够更快一点, 能够更省一点, 其结果便是细胞状态愈发糟糕, 最终只能无奈地选择从头开始再次尝试。
要是此刻你正因耐药细胞株而处于极度困扰、万分苦恼的状态, 那不妨暂且停下, 思索一番: 是不是施加于细胞的压力过于沉重了？是不是培养基的构成成分应当进行优化了? 是不是需要转变一种思路, 先去验证一下耐药机制之后再开展下一步行动?
有时候，把节奏慢下来，反而更快。
