说实话，我第一次接触耐药细胞株的时候，整个人是懵的。
那时正在一个周五的下午, 实验室的空调坏掉了, 天气是三十七度的那般炎热, 培养箱当中发出嗡嗡的声响。我望着那瓶处于贴壁状态的细胞, 明明就在昨天它生长的状况还挺好的, 然而今天培养基却黄得呈现出透亮的样子——后来才了解到, 这东西正处于慢慢死去的进程中, 不过实际上它是能够承受得住的。
耐药细胞株, 实际上就是针对细胞施行“疫苗”注射操作, 致使其对于特定药物产生不敏感的情况。然而, 其中所蕴含的具体细节, 相较于你所设想的程度, 要复杂深奥许多。
为啥要弄这么个东西？
你可能会想，好好的细胞干嘛要让它耐药？这不是自找麻烦吗？
其实不是。
设想一下, 肿瘤之所以难治的缘由是什么呢? 那是由于癌细胞会发生变异现象, 并且会渐渐对化疗药生成耐受性。倘若你不清楚它是怎样产生耐药性的, 那么你就没办法预先设计出应对的方案。耐药细胞株就是那个起着“将问题呈现出来的模型” 的作用——它向你表明, 细胞在压力状况下会发生怎样的变化。
建株的过程跟养孩子似的
没有捷径。
拿低浓度的药, 一点一点地往上加, 今天加零点几微摩尔, 明天加的是之前两倍, 这过程缓慢, 着实磨人, 我见过时间持续最长的, 历经八个月才稳定。
并且, 你是根本没办法偷懒的。每一种浓度的药物, 都必须要维持个两到三周的时间, 要观察到细胞开始适应了之后, 接着再向上增加浓度。在这个过程当中, 会有一大批细胞死掉, 这是非常正常的现象, 你必须得接受这种情况。
曾经, 有一位师姐跟我说了一段话, 我直至如今都还记得——那便是, 在建株的开头三个月期间, 你不会获取到任何东西, 而在建株的后续三个月时段, 你不会想要舍弃任何事物。
耐药指数怎么算？标准在哪？
很多人拿到耐药细胞株的第一件事就是算耐药指数。
耐药株的IC50, 除以亲本株的IC50, 公式并不复杂。然而, 若是这个比值低于5，坦率而言, 实在不太够用。
我的经验表明, 比值起码得达到10以上, 这才能够算得上是真耐药呀。如果低于这个数值，那或许仅仅不过是细胞一时出现的应激反应罢了, 经过传几代之后就会恢复原状的。
另外存在一个坑, 不少人计算IC50之际, 借助SPSS或者GraphPad直接跑出来的结果, 有时候会和手动计算的结果存在偏差, 你最好将两种方式都做上一遍, 进行核对。
耐药细胞株会“反水”吗？
会。而且很常见。
我有一位朋友弄的耐药株, 构建已经一年多的时间了, 其耐药指数曾经一度超过五十, 然而后来有一回放假归来之后, 却发觉耐药性居然下降了一大半。究竟是怎么一回事呢? 原来是在培养的过程当中加药浓度未能保持稳定, 并且中间还出现了几次漏加的情况。
故而你需留意, 平常之时加以培育, 药物的浓度是绝不能够中断地。哪怕是在周末的时候没有人, 也必须事先把用于培养的介质调配成功, 并且添加好药物。
此外, 当传代次数过多时, 耐药性随之会逐渐丧失。通常来讲, 代次被建议掌控在20代以内。一旦超过这个数值, 最好再次测量一下耐药指数。
实验室里常见的误区
说几个我踩过的坑，希望你别再踩。
第一点, 存在一种观点是, 认为耐药性与药物浓度呈现出完全的正相关关系。然而, 实际情况并非如此。在某些情形下, 部分细胞处于中间浓度时, 其生长态势反而是更好的, 这种现象被称作“激素样效应”, 它是非常违背直觉的, 不过却是真实存在的。
另外一个方面, 对于耐药细胞所呈现出的形态改变予以忽视。存在着这样一些情况, 部分耐药株会转变为圆形, 部分耐药株会长得较为稀疏, 另外还有部分耐药株会出现贴壁能力变弱的现象。而实际上这些变化乃是细胞针对其代谢通路进行重新调整的表现, 对此你必须加以重视。
第三个, 是耐药株的冻存以及复苏, 其操作需要迅速。这是由于它们自身本就较为脆弱。慢冻快融乃是基本准则, 然而好多人一旦忙碌起来便会忘记将防冻液里的DMSO浓度调节至合适状态。
怎么判断你的耐药株是“好”还是“坏”
一个好用的耐药株，有几个硬指标：
稳定性够。冻存后再复苏，耐药性能恢复到原来的80%以上。
耐药指数够。我刚才说了，至少10。
遗传背景清晰可辨, 你必须要清楚它究竟是以何种方式产生耐药性的, 究竟是药物外排机制得以增强了, 还是靶点发生了突变, 又或者是代谢通路出现了路线改变?
最后的那一个, 是存在着要让它能够“回头”这种情况。这其中所表达的是什么意思呢? 便是它必须得能够实现, 在不存在药物压力的状况之下, 逐渐地恢复成为敏感株。如此才能够表明它的耐药这一特性是具有可逆性的, 并非属于永久性基因突变。
否则，你研究的是个死模型，不具临床转化意义。
最后一点碎碎念
建耐药细胞株这事，说难不难，说容易真不容易。
它所考验的并非是你技术究竟多么过硬, 而是在于你是否具备耐心, 我见识过好多人在建造到一半的时候就选择予以放弃, 原因是他们认为“毫无意义”“太过缓慢”“反正肯定发不出高分文章”。
但是, 你可知道究竟什么才算是真正意义上的科研呢? 那便是那些没有任何人愿意去从事的, 既辛苦又劳累, 还显得有些笨拙的工作, 然而, 最终却反倒能够挖掘出一些实实在在的有价值的东西。
耐药细胞株呈现出这般的存在状态, 它宛如那样的一面镜子。这面镜子映照出细胞于极端环境之下所持有的求生欲望。而你所要去进行的之事, 便是陪伴它走过这一段路程。
别着急。慢慢来。
