说实话，我第一次做荧光标记抗体实验的时候，整个人是懵的。
那种呈现为绿色的光, 于显微镜之下亮到令人眼睛发花 , 我原以为自身发觉了某种极为了不起的信号 , 兴奋得双手颤抖不已 , 然而到了第二天再度去查看 , 却不见了 , 完全地消失了 , 恰似我头天夜里所做的一场梦 , 待醒来后仅仅剩下枕头上的口水印迹。
荧光猝灭这件事，是真的磨人。
后来, 有一位老前辈瞧见我满脸愁容, 递给我一杯咖啡, 说道: “你晓不晓得, 荧光标记抗体这个玩意儿, 从本质上来说, 就是一个能够发光的小炸弹? ”我当时愣了一下。他话语虽说得粗糙, 然而道理却并不粗糙。
为什么荧光标记抗体这么容易掉色？
有不少人在拿到试剂之际, 其第一反应便是——赶忙动用。将包装拆开, 予以稀释, 进行上样, 开展拍照, 整个过程畅快连贯。接着却发觉, 哎唷, 为何拍出来的效果越来越昏暗呢?
这其实不怪你，也不怪试剂。
荧荧之光分子此物, 生性便颇欠稳定。其仿似一位精力超量之孩童, 汝馈予其一缕光, 彼即可兴高采烈地踊跃起来放光。然而难题在于, 彼踊跃之际渐次感疲惫。光化学领域中将此称作“光漂白”, 简言之便是——彼把能量消磨殆尽, 再也无法明亮发光了呀。
而且荧光标记抗体还面临另一个问题：标记本身可能会掉。
我曾目睹有人将抗体置于4度的冰箱之内, 一放即成半年之久。半年过后取出, 荧光已然淡至仿若隔夜之茶般。事实上, 荧光分子与抗体的结合, 并非坚不可摧毫无破绽。时日一久, 温度出现偏差, 或者pH值稍有偏移, 那连接便有可能断开。荧光分子自行逸出, 抗体依旧留存原处, 然而它已然不再散发光亮了。
这便是为何你所见到的信号愈发微弱, 并非抗原消失不见, 而是你的“侦察兵”将自身的信号灯遗失了。
荧光标记抗体到底该怎么保存？
这个问题，说出来可能有点丢人。
过去我自行做标记之际, 常常随意地将抗体丢进冰箱, 心里想着“反正存有防腐剂”。然而某一日发觉, 同一批次的抗体, 那前一天的与后面一天呈现的结果全然不一样。
过后, 我详尽地查阅了文献, 才发觉问题的根源所在, 便是, 荧光标记抗体最惧怕的并非低温, 而是反复冻融以及光照。
你或许心里会想, 这冻融, 不就是取出来用一回然后再放回去? 但是, 要晓得每一回的冻融, 都会致使抗体蛋白的结构产生微小的变形情况存在。而那群变形持续积累起来, 抗体的结合能力便会随之下降了。更不要去说荧光分子自身所具备的稳定性了——它们对于光可是极其敏感的, 哪怕仅仅只有微不足道的一点环境光, 也都会逐渐地去消耗抗体的发光潜能。
所以正确的做法其实是：分装！分装！分装！
重要的事情说三遍。
将一大管抗体划分成若干微小份额, 每一个这样的份额仅够一次使用, 若有剩余未用完的就径直丢弃, 别为此心疼, 如此这般操作存在的益处便是, 你每一次所使用的皆是“新鲜”状态, 不会因反复取用进而致使整管试剂遭受污染或者呈现降解情况。
并且, 避光进行保存并非是在开玩笑的。我所见过的最为夸张的那种行为做法是, 存在有人使用铝箔纸将抗体管包裹形成了三层, 在这之外又套上了一个黑色的密封袋子。尽管看上去好像有点神经质的样子, 然而其效果实际上确实是挺好的。
为什么你的荧光标记抗体总是出现非特异性染色？
这个问题其实特别容易让人崩溃。
你费力劳心地干了好长一阵子, 好不容易完成。然后小心翼翼放上显微镜观察, 却惊异地发觉这一整张片子全呈现为绿色。而且那背景明亮得好似圣诞树一般。你根本没办法辨别清楚究竟哪一部分才是真正的信号, 哪一个又是噪声。
我当时差点把显微镜砸了。
以后我总算渐渐弄清楚, 关于非特异性染色这一情况, 八成的缘由是出在封闭以及洗涤之上。
很多新手, 包含我当年, 都觉着, 封闭液随意用用便可, 洗洗走个过场就行。然而, 荧光标记抗体与普通抗体不同, 它灵敏度更高, 对杂质容忍度更低。要是你没将组织或细胞里的非特异性结合位点彻底封闭, 那些多余位点就如同没锁的门, 荧光标记抗体轻易就钻进去了。
解决的办法实际上并非繁杂到不堪设想: 采用具备高质量属性的封闭液, 将封闭的时间予以延长, 对于洗涤的次数丝毫不要有所节省, 甚至能够去思索增添洗涤液当中Tween - 20的浓度。
还有一点，很多人会忽略——抗体的稀释度。
难道你觉得稀释度越高之时, 背景就会越干净吗? 并非如此。要是过度进行稀释的话, 就会致使信号太过微弱, 进而你不得不去提高曝光时间, 如此一来, 背景的噪声也就随之升高了。最佳稀释度是一个得靠自己去摸索的参数, 千万别迷信说明书上所给出的推荐值。
荧光标记抗体到底能不能用于活细胞成像？
这个问题吧，我纠结了很久。
从理论层面来讲, 自然是具备可行性的。然而, 在实际开展操作的进程当中, 你能够察觉到, 针对活细胞成像而言, 对于荧光标记抗体所提出的需求, 相较于固定细胞要高出许多。
首先存在的是毒性方面的问题, 好多荧光染料其自身是具有毒性的, 特别是那些小分子类型的染料, 它们会逐步地渗透进入到细胞之中, 进而干扰细胞正常的生理活动, 当你进行观察细胞这个行为的时候, 此刻细胞或许已然被你给“看”得失去了活性。
紧接着是时间窗口, 活细胞成像一般来讲需要长时间去进行观察, 然而荧光标记抗体处于活细胞这样一种环境的时候, 更易于被内吞以及降解, 你或许拍摄了十分钟, 信号便开始衰减了。
有人问过我，有没有什么好办法？
以我个人的经验来讲, 要尽可能挑选那些具备良好光稳定性、细胞毒性较低的荧光染料, 当前出现了专门针对活细胞成像而设计构想的荧光标记抗体, 它们所拥有的标记物历经了特殊的修饰, 能够更为适宜活细胞所处的环境, 尽管价钱稍微贵一些, 然而却是值得的。
有一种土办法, 将激发光的强度予以降低, 把曝光的时间加以延长, 如此一来, 虽说单张图片的光强会稍微弱一些, 不过荧光分子被漂白的速度会大幅度降低, 进而能够拍到更多的时间点, 听起来违背直觉, 然而确实有用。
荧光标记抗体和普通抗体的区别到底在哪？
这个问题，其实挺根本的。
像一把钥匙般的普通抗体, 它能够精准地找寻到作为锁的抗原, 接着卡入进去, 然而你却无法看到它所处的位置, 除非运用其他手段对其进行检测。
带荧光标记的抗体, 就好比是给那把钥匙安上了一条会放光的尾巴。它不但得能够精准无误地寻找到锁具, 而且在寻找到的时刻还要释放出光芒以便让你可以瞧见。
这个“发光尾巴”存在着, 带来了两个直接问题, 其一, 它使抗体的大小以及分子量得以增加, 这恐怕会对抗体的渗透性与结合能力产生影响, 其二, 它致使抗体的不稳定性有所增加, 原因在于发光分子其自身便是一个额外变数。
因此, 别期望荧光标记抗体跟普通抗体的呈现全然一致。要是你要开展荧光实验, 最好径直去购置荧光标记的抗体, 而非拿手头的普通抗体自行去标记。自行标记的批次存在颇大差异, 质量把控也难以给予保证。
写在最后
写到这里，感觉自己啰嗦了不少。
荧光标记抗体这东西，说难也难，说简单也简单。
艰辛之处在于, 你需仿若对待一只敏感的小动物那般去悉心照料它, 即要避光, 要保持低温, 要进行分装, 还要优化条件。简易之处在于, 只要你将这些细节均落实到位了, 它便能够为你展现出那些肉眼无法看见的美妙信号。
甚至于直至今天, 我依旧清晰地记着，当首次成功制作出一幅精美绝伦的荧光染色图之际, 所感受到的那般强烈震撼。那些呈现为绿色以及红色的光点, 于漆黑的背景之上, 仿若星星一般光芒闪耀。就在那般个时刻, 你会萌生出一种感觉, 先前所有历经的手忙脚乱和陷入抓狂的状态, 皆是具备价值的。
或许这便是科研所具备的魅力所在了——你始终都在寻觅一个肉眼无法看见的事物, 而你所要践行的, 乃是为它装设一盏亮度足够的灯。
