我真是服了。
搞实验最担忧的是什么? 并非害怕熬夜, 而是害怕你辛辛苦苦熬了一整个夜晚, 然而最终PCR机子所呈现给你的曲线却如同心电图那般，即是什么名堂都瞧不出来。
所谓荧光定量PCR, 实际上就是一个如同放大镜加上计数器一般的存在, 你要是拥有哪怕仅仅一点点的DNA, 它能够给你放大至几百万倍之多, 而且还能够告知你最开始的时候究竟有多少, 这项技术是不是很厉害呢, 确实是非常厉害, 然而使用它的时候却可以用两个字来形容, 那就是: 折腾。
我刚接触那会儿，真的是被它折磨得不要不要的。
为什么你的扩增曲线总是一条直线？
我打这样一个赌, 十个从事qPCR的新手当中, 会有八个目睹过这般画面, 那便是扩增曲线如同死人心电图那样呈现极度平缓的状态, 偶尔还会出现一些幅度微小的隆起, 看似貌似是实现了扩增, 然而实际上纯粹只是背景中存在的噪音罢了。
为啥会这样? 是DNA降解了, 是引物设计存在问题, 是模板没有加进去, 又或者仅仅是在操作的时候手抖那么一下。的确如此, 真别笑, 我认识一位师兄, 在加样之际打了个喷嚏, 随后他那一板的数据就全都作废了。
最为坑人的是, 有时你误以为不存在问题, 原因在于内参基因电泳等跑得挺好。然而目标基因呈现出一条直线状。这到底称作什么? 这被称作“即便内参没毛病也并不意味着你整个实验状况完好”。再言那内参基因属于管家基因范畴，其具备表达量颇高, 以及稳定性颇佳的特点, 故而愚弄你可以说是比较轻易就能达成的。
熔解曲线出现双峰怎么办？
这问题我当初纠结了三个月。
双峰, 瞅着就闹心, 这表明你的PCR产物不纯净, 存在非特异性扩增或者引物二聚体的情况, 简单来讲就是除了你所期望得到的那个片段之外, 还扩增出了其他的物质。
到底该怎么办? 首先, 要去查看一下你的引物设计是否存在问题, 是不是gc含量过高或者过低? Tm值之间的差异是不是太大了? 有没有形成二聚体那样的可能性? 而这些情况其实都是能够运用软件提前进行预测的。然而, 有很多人贪图简便省事, 直接借助一个在线工具随意操作一番就拿去上机了, 随后就只是等着要看双峰的情况了。
又存在着另外一种可能性, 那就是退火时的温度处于过低的状态, 将其提升个二至三度去尝试一下, 有时情况就是这般简单。
唯最为令人作呕者, 乃是你已然调节了温度, 更改了引物, 再度进行了实验设计, 然而最终依然存在双峰现象。于此际, 你便需要去怀疑, 究竟是否为你的模板自身存在污染, 又或者留存有基因组DNA的残留之物致使这种情况的发生。可能是在RNA提取的过程当中, DNase处理欠缺完善, 进而导致扩增所产生的信号之中有一部分来自于基因组DNA。
CT值总是忽高忽低是什么鬼？
这个问题，问的人最多。
今日跑出来的结果是CT等于25, 明日相同的样品跑出来CT等于28, 而后天直接呈现给你来一个32, 你究竟该相信哪一天呢, 其实哪一天都不该相信。
八成是操作问题导致稳定性差, 荧光定量PCR这东西比普通PCR娇气得多, 加样误差会影响结果, 移液枪的校准会影响结果, 样品降解会影响结果, 甚至加样时气泡的大小也会影响结果。
曾经有一回, 我察觉到自身的 CT 值出现了剧烈的飘动情况, 一番查找, 始终寻觅不到致使其如此的缘由, 直至后来, 才发觉原来是我手中那支容量为 200 微升的移液枪需要进行校准操作了。它吸取 20 微升液体时, 实际上仅仅能够吸纳 18 微升。仅仅相差了如此微小的量, 竟然整个重复性就被完全破坏掉了。
再者是样品均一性方面的问题, 组织出现研磨不均匀, 裂解过程存在不完全状况, RNA提取效率呈现出不一样的情形, 这些状况都会致使CT值产生波动。
为什么阴性对照也出现了扩增？
这问题一出现，整个实验就可以重来了。
呈阴性的对照出现信号, 这表明存在污染情况。其或许是你的试剂遭受了污染 , 又或许是在进行加样操作的时候不小心将样品混入其中了。有人于操作期间习惯把盖子打开 , 而后在那里讲话 , 飞沫当中的DNA极有可能掉落进去了。
我记着有回实验室里的师妹做qPCR, 阴性对照全都出现CT值了。她难过了一整天, 之后才发觉是她所用的枪头盒被污染了。那枪头盒呀, 你没办法看见也摸不到它, 可它就是存在问题。
要怎样解决呢? 操作时严格分区, 试剂准备的区域与样品加样的区域得分开, 使用带有滤芯的枪头, 手套需要频繁更换, 操作的台子要定期运用酒精以及紫外进行灭活。
荧光信号太弱怎么办？
信号弱，说明扩增效率低。
要么是模板量不够，要么是引物效率差，要么是反应体系有问题。
尝试去增加模板量, 或者对引物浓度予以优化, 这是可行的。通常情况下, 引物的终浓度处于0.1至0.5微摩的范围之中, 然而至于精确的数值究竟是多少, 最为恰当的做法是进行梯度优化。
还有, 就是你所用的荧光染料是不是应该去更换成新的了? SYBR Green这个物品, 反复进行冷冻和解冻的情况之下会出现降解现象, 随着时间经历得长久起来其效果就会变差了。
存在一个诸多人士都忽视的细微之处: 那便是反应液的均匀混合。在完成加样操作之后, 要是不进行一次离心处理，或者不借助移液枪轻柔地予以混匀, 那么反应液极有可能呈现出不均匀的状况, 如此一来, 荧光信号理所当然地就会微弱。
数据处理到底怎么才算对？
这问题比实验本身还让人头疼。
qPCR所显现的数据, 你必须要运用2^-ΔΔCT法去计算相对定量。好多人直接将CT值进行比较, 那是不正确的。你需要先计算ΔCT等于目标基因CT减去内参基因CT, 接着再计算ΔΔCT等于实验组ΔCT减去对照组ΔCT, 最终才是2^-ΔΔCT。
另外, 你所使用的内参基因其表达务必保持稳定, 倘若不稳定, 那么你推算得出的数据通通都是无价值的, 要用何种内参呢? GAPDH、ACTB、18S rRNA均可, 但最好先对其在你的实验状况下表达是否稳定加以验证。
设有一友人, 其从事qPCR数据工作达一整年之久, 最终却发觉, 于其开展的实验组以及对照组当中, 自身所采用的内参基因, 乃是它的表达量上存在着三倍的差距情形。如此一来, 这一整年的时光就等于是白白耗费掉了。试问, 这般状况惨乎不惨呢?
写在最后
荧光定量PCR这个技术，说难不难，说简单它也不简单。
使用状况良好的情形下, 每一板存在九十六个孔, 数据状态呈现得极为出色, 统计所获结果具备显著特性。而处于使用状况欠佳的状况时, 那便等同于在进行烧钱行为。
我感触最为深刻的是, 去从事科研工作, 尤其是进行qPCR相关的科研, 光是脑子聪慧那是远远不够的。它要求你具备耐心, 还得拥有细心, 甚至在某种程度上要有强迫症的特质。每一个步骤都必须要做到尽善尽美, 每一个步骤都绝对不可以敷衍了事。
糊弄它，它就糊弄你。
确实, 千万别轻视那些看上去最为基础的操作, 像加样之前先进行涡旋一番, 离心短短几秒钟, 检查一下枪头的密封情况。这些细微的小节, 常常就是决定你实验成功或者失败的关键所在。
我如今于做实验之前, 都会先让自己安静下来，去思索一回流程, 琢磨哪些地方有着出现问题的可能性, 哪些地方需要进行额外注意。宁愿做得稍微慢一些, 也绝不要出现差错。
毕竟，实验做得漂亮，发文章才有底气，毕业才有希望。
