老实说，我刚进实验室那会儿，根本不知道二抗是个什么玩意儿。
只记得师兄把一管透明液体扔了过来, 还说着“加这个” , 我便加了进去。后来跑出来的条带就黑得如同碳一般 , 背景脏得好似被洒上了墨一样。师兄看了一下 , 无奈叹气说: “你二抗的浓度实在是太高了。”。
那一刻，我其实还是没搞懂二抗到底是什么。
但后来我慢慢明白了，这玩意儿吧，说穿了就是个“翻译官”。
想着, 一抗可是个极为挑剔的家伙, 其仅仅辨认某一特定的蛋白, 然而你没办法直接去看见它。一抗身上并未带有什么显眼的标记。就在这时候二抗登场了, 它仿若一个训练有素的侦察兵, 专门去寻觅一抗, 而后紧紧地抱住它, 接着亮出自身身上的荧光或者酶, 告知你嘿, 你所要找寻的那个蛋白在这儿。
说得直白些, 二抗乃是一抗的“尾巴”, 它是我们于显微镜或者胶片之上得以看见信号的关键所在。
为什么你的二抗总是出问题？
我踩过的坑，真不少。
极其荒谬的一回, 我更换为另一个品牌的二抗, 然而不管怎样跑, 全膜都持续发光。背景亮到仿若太阳一般, 目标条带反倒难以分辨出来了。当时我差点就把面膜给撕掉了。
后来才知道，二抗这东西，讲究个“物种匹配”。
举例来说, 倘若你的抗某种抗原的第一抗体是源自小鼠的, 那么第二抗体就必定得是对抗小鼠的, 要是你选用了对抗兔子的第二抗体去搭配源自小鼠的第一抗体, 那这情形就相当于安排一个完全不知路径的人去迎接一个根本就不存在的宾客, 整个局面全乱套了, 完全失控了。
还有浓度，浓度啊兄弟们。
我头一回使用二抗之际, 瞧见说明书里面注明为1:5000, 我当时就寻思, 增添些量是不是信号会更强烈呢? 于是添加成1:1000, 然而整张膜呈现出一片黑乎乎状况, 目标条带被淹没于背景之中, 恰似大海捞针那般。
过后前辈跟我讲, 二抗这个事物, 宁可少些也不要多些。倘若多了也就是困苦了, 若是少了最多只是信号微弱点儿罢了, 而且说不定还能够弥补。
二抗到底怎么选？别被参数忽悠了
现在市面上的二抗多得让人眼花缭乱。
那被HRP标记的, 那被AP标记的, 那被荧光标记的……仅仅只是看着名字, 就让人感觉脑袋发大心烦意乱了。
我自己的经验是，先想清楚你要干啥。
于Western blot实验操作中, HRP标记的二抗乃是主流之选, 其具备价格低廉且使用便捷之特点, 曝光所需时间颇为短暂, 呈现出的条带清晰可辨。然而, 若你计划开展免疫荧光操作, 那么便则必须选用荧光二抗, 并且还得着重留意荧光波长之事宜, 切不可使其与细胞自身所发出的荧光产生重叠现象。
还有一点很多人忽略：二抗的纯化方式。
可与你组织切片细胞里内源性免疫球蛋白产生交叉反应的便宜二抗, 会出现非特异性染色情况, 即全片呈现绿油油或是红彤彤荧光, 看似热闹, 实则皆为假信号。
我在那之后, 仅仅购买那种经过了预吸附处理的二抗, 虽说它的价格要稍微贵上一些, 然而其背景干净的程度厉害到让人都想落泪了。
一个让我醍醐灌顶的细节
一日, 我于阅览一篇往昔文章之际, 忽地留意到一个细微之处, 即那位作者于其方法中著有这样一句话, 曰: “二抗孵育之后, 洗涤的次数不得少于五次, 且每一次均为十分钟。”。
我当时就愣住了。
平常我仅仅洗三次, 每一回五分钟。是不是鉴于此, 我的背景始终降不下去?
后来我进行了尝试, 这是真的。洗5次与洗3次相比较, 效果存在极大差异。多洗两次的话, 背景能够浅一半。其中的道理并不复杂, 没结合上去的二抗会残留在膜上, 要是你没有将其洗干净, 它们就会在曝光的时候发光, 进而变成那层令人心烦的灰雾。
你看，有时候不是试剂的问题，是手的问题。
二抗不是配角，它是你的最后一张牌
很多人觉得二抗嘛，随便买一瓶，凑合用就行了。
可是你琢磨琢磨, 在整个实验当中, 对于一抗你是精心挑选出来的, 对于样品你是谨慎小心去处理的, 转膜的时候你花费了好长的时间才完成, 最后要进行的关键一步就是二抗操作, 然而因为二抗这一步骤出现了失误, 致使前面所付出的全部努力都付诸东流了。
二抗就是你最后一张牌，打好了，全盘皆活；打差了，前功尽弃。
而且啊，这玩意儿还有保质期的。
我曾翻出一管两年前的二抗, 心里想着都是抗体, 应该还能够用吧, 结果跑出来的条带如同残影, 模糊到了不行的地步, 后来看了说明书, 才发觉HRP标记的二抗, 在4度保存大概也就一年左右, 时间一长酶活性就会下降。
还有，二抗千万别反复冻融。
一部分人在进行分装操作之际偷懒, 径直将整管予以冷冻, 待使用之时再进行解冻, 剩余部分又重新冷冻回去。如此这般操作两三次后, 二抗便宣告报废。其中所含的抗体极有可能已然聚集, 其浓度甚至比背景还要高出许多。
最后说点掏心窝子的话
有不少新手是我见过的, 实验失败后就跑来询问, 是不是一抗有问题, 是不是样品存在问题, 是不是转膜出现问题了。
其实很多时候，问题就出在二抗上。
浓度出现偏差, 种属存在差错, 保存方式不妥当, 洗涤程度不充分……这些看起来毫不起眼的细微之处, 完全能够将你一周的辛劳付诸东流。
所以呢, 往后要是再有其他人讲“二抗可不就是个工具罢了”, 你就咧咧嘴, 啥也甭言语。
待到你瞅见他奔出来时膜呈现出全然一片乌黑深邃之态, 而后悄然无声地递予其一瓶崭新的二抗, 对着他言道: “去试用这个, 比例为1:10000。”。
那感觉，比发了高分文章还爽。
