我靠，这东西真有人觉得是玄学？
实话说, 我刚开始接触那个时候, 也是处于懵懂不清的状态。诸如Ct值、扩增曲线、熔解峰等等, 这一系列的术语扑面而来, 搞得脑袋疼。而后进行了几百个样本的操作, 才渐渐地摸索到了一些门路。
荧光定量PCR, 简单说呢, 就是给DNA安上了一个监控摄像头。你注视着它进行扩增, 留意着它发出光亮, 观察着它向你传达“有”及“无啊”, “多呀”还有“少哇”。
但问题是——光环背后，坑也不少。
荧光定量PCR到底看什么数据？
很多人拿到报告就盯着Ct值，觉得越小越好，越大越差。
道理没错，但不全对。
Ct值的实质是“阈值循环数”, 此即你样品当中荧光信号超越背景噪音的那一帧, 它与初始模板量呈反比关系, 也就是模板数量越多, 便会越早显现出来。
你得清楚, Ct值会被好些乱七八糟的因素给影响着, 比如说提取效率, 反转录效率, 反应体系中的抑制剂, 甚至就连你加样的时候手抖那么一下下, 最终都能够在结果上差出来个两三循环。
因而, 别仅仅盯着Ct值的绝对值。得去看其走向, 得去看相互间的比较, 得去看内参基因是否稳定。
从事绝对定量那一系列操作，倘若标准曲线的R²低于0.99, 我提议你直接重新去做。不要自我欺骗, 因为数据不会说谎。
实验总是做不出来怎么办？
哎，这个问题问得好。几乎每个人都会遇到。
你先别急着怪试剂、怪机器、怪运气。从头排查一下：
样本的质量情况, RNA是否出现降解现象, DNA当中是否存有残留蛋白或者酚类物质, 这些东西可是PCR的天然克星。去跑一次琼脂糖凝胶观察条带, 亦或是测一下260/280比值, 心里便有底了。
进行引物设计, 到底是不是特异性欠佳, 到底是不是形成了二聚体, 到底是不是Tm值相差过多, 就算将哪怕最便宜的在线工具用于此设计, 也得开展一次普通PCR验证, 之后再投入到qPCR之中。
把退火温度, 直接无视优化这一关键环节, 就用引物说明书上给出的温度, 有人这么做, 我见了觉得特别离谱万分诧异。大哥呀, 说明书给的只是做参考的数值, 可不是必须绝对遵循的圣旨。梯度PCR一定要跑上一轮, 从而找到最合适的温度, 这一步骤是绝对不能省掉扔下不管的。
模板的浓度, 要是过于浓了, 那会对反应起到抑制作用, 若过于稀了, 又没办法检测出来, 要进行梯度稀释, 去找到一个恰当合适的稀释倍数, 可千万别贪图过多。
要是上面这些都进行检查了之后仍然不见效……那你去尝试更换一个试剂盒。偶尔情况就是批次方面惹的祸, 接受这个事实就可以了。
熔解曲线到底怎么看？
很多人只会看一个峰值。
但你需明白，单峰并不意味着全然单一, 两个峰值若靠得过于接近, 软件便有可能将其合并为一个, 唯有进行一次琼脂糖电泳, 或者开展一次测序, 方可百分百确定扩增产物乃是你所需之物。
此外, 要是熔解曲线呈现多峰情形, 切勿急于删数据。首先去瞧瞧非特异性产物的大小状况, 进而判断它能否借助优化反应条件加以去除。有的非特异性产物并不会对定量造成影响, 例如目标条带与非目标条带的大小有着足够大的差距, 能够于数据分析阶段手动予以区分。
可是要是你所进行的是染色方法, 多个峰的情况下就意味着或许并非是纯粹的聚合酶链反应产物, 要么是引物存在问题, 要么认为可能是有模板方面的污染, 要么就是反应相关条件不合适。
这个时候，STOP。停下来找原因，别硬跑。
内参基因怎么选才靠谱？
你要知道，内参基因不是随便找个“常用”的就能用。
在不同的组织当中, 还有不同的处理条件之下, 内参基因的表达量是会发生变化的。你自认为自己正在校正误差, 然而实际上你却引入了一个新的误差源。
较为妥当的举措是: 起码挑选三个可供候选的内参基因, 诸如GAPDH、ACTB、18S rRNA, 运用geNorm或者NormFinder这类专业工具去筛选出最为稳定的那一个。虽说会有些繁琐, 然而能够让后续的数据更具说服力。
此外, 内参基因的Ct值, 不可太过离谱, 稳定在15到25之间为佳, 太小意味表达量过高, 或许会被样本波动掩盖, 太大表明表达量过低, 自身误差偏大。
别偷懒。做一次筛选，一劳永逸。
绝对定量和相对定量选哪个？
要是你能够达成购买或者自行制备标准品这一行为, 而且还知晓绝对拷贝数, 那么就进行绝对定量, 这适合病毒载量、转基因拷贝数这类的场景。
然而, 标准品并非那般易于制作。质粒标准品要求精准测定浓度, 而后换算成拷贝数, 其中每一步骤皆存在误差。RNA标准品则更为繁杂, 极易发生降解。
所以, 多数实验室采用相对定量, 去比较目的基因与看家基因的表达变化状况, 其具备简单、经济以及实用的特性, 只要处理组同对照组之间的扩增效率保持一致, 那么结果便是可靠的。
存在一个坑, 进行相对定量时, 扩增效率最好处于90%至110%之间, 并且目的基因与内参基因的效率需要相近, 否则算出来的倍数比是错误的, 看着美观, 实际上并无用处。
数据怎么解释才不翻车？
拿到数据先别急着下结论。
其重复性究竟如何, 三个生物学重复彼此之间, Ct值的差异是否已然超过了0.5, 那技术重复之间又是怎样的情形?
若是差异极大, 首先出现的反应并非去寻觅缘由作出解释, 而是再次实施一遍试验操作。可切莫让失误沦为存在于你论文里面那个遭受他人质疑的破绽之处。
另外, 要查看p值, 要查看置信区间, 要查看效应量。别仅仅依靠一个“有显著性差异”就结束。有多少实验室在重复实验当中再也无法复现出当初“显著”的结果呢? 数据造假是少数情况, 而过度解读是多数情况。
客观一点，诚实一点。科学不是讲故事，它不需要戏剧性。
荧光定量PCR这类事物, 讲难并非难, 讲简单也并非简单。它属于一种工具, 重点在于你如何去运用它。
别把它当玄学，也别把它当万能药。
增加重复的次数, 增添对照的数量, 多提出几个为何。数据会将真相告知你。
