说实话，我第一次接触流式抗体的时候，整个人是懵的。
何种荧光素, 何种克隆号, 何种滴度, 这般一堆术语投掷而来, 感觉仿若在聆听天书。彼时我便思索, 倘若有人能够径直告知我“购买哪一个, 如何去使用”, 何等美妙。
此后历经了数不清的坑, 耗费了许多钱财, 才逐渐摸索出些许窍门。今日所写的这一篇, 便是想要让往昔那个愚笨傻气的自我, 少经历些曲折。
流式抗体到底是个啥？
简单说，就是给细胞“贴标签”的东西。
你的细胞呈现怎样的样态, 其表面存在何种蛋白, 它的内部蕴含哪些物质……流式抗体恰似一面面小旗帜, 插置于细胞之上, 而后流式细胞仪能够见到这些旗帜, 向你告知: 噢, 这一群细胞属于T细胞, 那一群是B细胞。
可是, 问题就出现了, 在市场上面存在着数量众多的抗体, 每一个抗体无一不是声称自身具备“高特异性” , 同时又具备“高灵敏度” , 那么究竟该相信哪一个?
克隆号为什么这么重要？
这是我最想说的。
许多人在购买抗体之时，仅仅是去看名字, 就如同“CD3抗体”这般, 认为它们全都是一样的。这是错误的！简直错得离谱！
在相同的那个CD3之中呢, 存在着OKT3克隆, 存在着UCHT1克隆, 存在着SK7克隆等等, 它们所识别的乃是同一个蛋白质的不一样的位点。其中有些克隆会产生相互冲突的情况, 而有些则不会。倘若你选择将它们混合起来加以使用, 那么最终的结果极有可能形成一团糟糕的状况。
还有个朋友, 他做的是涉及多种颜色识别的流式技术, 从中挑选了四个抗体, 然而呢, 其中两个克隆居然相互竞争同一个能实现捆绑的位置, 以致信号直接垮掉了。为此他瞎琢磨鼓捣了足足两周时间, 最终才弄明白原来是克隆号方面出现了问题。
所以, 不要偷懒。在购买之前, 去查询一下克隆号, 看一下是否有文献给予支持, 是否有人进行过验证。
荧光素该怎么搭配？
这个问题，新手最容易翻车。
你去思考一下, 流式细胞仪存在着诸多通道, 每一个通道针对不同波长的光展开检测。要是你将两个发射光谱极为相近的荧光素放置在一起, 仪器根本无法辨明谁是哪一个, 便如同两个人同时进行讲话, 你无法听清究竟是谁在讲述什么。
我所给出的建议是, 要先起始于经典的配色, 就像FITC以及PE, 这两种光谱相互之间距离较远, 不会产生冲突。待经验变得丰富之后，再去尝试那些较为冷门的荧光素。
还有, 荧光素的亮度可得留意着。有些荧光素亮得很突出, 像PE、APC, 适宜用来检测低表达的抗原。有些亮度较暗, 比如FITC, 适合用于高表达的抗原。倘若把暗的荧光素配给低表达的抗原, 结果便是啥都瞧不见。
滴定实验真不能省
我知道，这一步很烦。
每当去购置新的抗体之时, 通常需要开展梯度稀释的操作, 以此来寻觅到最为适宜的用量。倘若用量过少, 那么信号将会显得微弱；要是用量过多, 不仅背景会变高, 而且还会出现非特异性结合的状况。
但这一步省了，后面的实验就是在碰运气。
我曾目睹有人依照说明书推荐用量直接去做, 结果呈现出来的图既难看又杂乱。随后经过查询得知, 他所用的那个批次抗体的浓度, 已然与说明书上面的存在差异了。
属于生物制品范畴的抗体, 不同批次间存在着差异, 滴定这一行为, 意味着你与该批次抗体的一次“握手”, 相互间达成认识之后, 才能够实现良好的合作。
保存和操作的小细节
别以为抗体买回来就万事大吉了。
流式抗体的很多种类惧怕光线, 也惧怕冻融情况。你要是把它放置在冰箱的门上, 每次开启门以及关闭门的时候会受到热量影响, 它就会渐渐地失去活性。最好是放置在冰箱的深处位置, 以便温度能够保持稳定。在使用期间, 迅速地将其拿出来, 取完之后要马上放回去。
另外, 在进行染色操作的过程当中, 务必要添加阻断剂, 细胞的表面存在着Fc受体, 其会与抗体的Fc段形成非特异性的结合, 进而导致出现假阳性的情况, 添加一个Fc阻断剂, 便能够将这个问题予以解决。
这些细微之处, 看上去并不起眼, 然而却决定着, 你究竟是能撰写出一篇精彩绝伦的文作, 亦或是对着杂乱无章的数据而发愁。
关于多色流式的那些坑
现在流行做多色，8色、10色、甚至20色以上。
听起来很酷，但操作起来，每一步都是坑。
最让人头疼的便是补偿, 荧光素一旦增多, 光谱重叠便会十分严重, 你不得不制作单染管, 以此来计算补偿, 并且, 每回实验的补偿皆有可能存在差异, 这是由于仪器状态以及抗体用量均会出现变化。
先是, 建议你去做小规模预实验, 以此来测试配色方案, 千万不要一初开始就去做几十个样本, 倘若万一配色存在问题, 那就全白做了。
另外, 多色流式所涉及的数据分析, 相较于实验本身来讲更具难度。你需要明白设门相关内容, 需要清楚降维分析方面知识, 需要懂得聚类相关要点……诸如此类技能, 并非短时间之内就能够掌握的。
因此, 要是你才刚开始入门的话, 那就先着手从2色来做起, 接着把3色也从事起来, 待将基本功给夯实稳固了, 然后再渐次地去增加颜色。
选品的小经验
我不是卖抗体的，但用过的品牌不少。
存在一些大品牌, 其质量具备稳定性, 然而价格却贵到超乎常理。还有一些小品牌, 它们具有较高的性价比, 只是批次之间的差异较为明显。我所采取的做法是: 对于关键实验部分使用大品牌产品, 而在筛选实验环节采用小品牌产品。
另外, 要多多的去查看文献。在同一篇文章当中, 使用了哪些品牌的哪些抗体, 一般情况下都是会有标注的。依照文献来进行, 踩雷的可能性就会小很多很多。
那些打着“全网最低价”旗号的广告, 千万别去相信。流式抗体这种物品, 遵循着一分价钱对应一分质量的规律。要是价格便宜得超乎常理, 那么极有可能是假冒伪劣的产品或者过期变质的货色。
最后说几句
写这篇文章的时候，我脑子里一直浮现自己当初手足无措的样子。
彼时, 实验室中无人对我予以教导, 完全凭借自身去查找资料, 向同行进行询问, 一次次反复尝试错误, 耗费了大量时间, 亦耗费了大量金钱。
这个流式抗体相关的事情, 讲起来难吧又并非特别难, 讲简单呢其实不然也并不简单, 重点在于, 得将其作为一个完整体系去学习, 而不是一个个零散的知识要点。
自进行选克隆操作起, 直至为其搭配荧光素, 再到开展做滴定工作, 而后着手设门分析……每一个步骤均具备相应的逻辑, 都存在特有的原理。一旦理解了这些内容, 你便不会被形形色色花哨的宣传所误导。
希望你能少踩点坑，早点做出漂亮的流式图。
毕竟，实验已经够累了，别让抗体选品再给自己添堵。
