我实在是受够了。
实验室里那台流式细胞仪，屏幕上的光点密密麻麻。
我盯着看了两个小时，眼睛都快瞎了。
结果呢？
全是死细胞。
不，不是凋亡，是坏死。
那群细胞死得毫无尊严，像被城管扫荡过的夜市摊。
我骂了一句脏话，把数据删了。
隔壁工位的小张探过头来：“师兄，你那个凋亡检测又失败了？”
我没理他。
为什么你的细胞总是不听话
说起来你可能不信。
我第一次做细胞凋亡检测的时候，信心满满。
跟着protocol一步一步走。严格到像在做炸弹。
结果出来的图，连我自己都不信。
阳性对照和阴性对照，长得一模一样。
像双胞胎。
我当时怀疑是不是试剂被调包了。
后来发现不是。
是我自己蠢。
我用的是贴壁细胞，消化的时候力气太大了。
细胞膜破了，Annexin V全进去了。
染得那个漂亮啊。但全假信号。
就像你化了浓妆去相亲，对方看到的根本不是真实的你。
你知道细胞其实很脆弱吗
它们不是你想的那样，躺在培养皿里任你宰割。
它们有脾气的。
你离心速度太快？它死给你看。
你胰酶消化太久？它碎给你看。
你离心之后所得到的沉淀, 吹打时要用力使劲吗? 它直接就处于一种消极怠工的状态, 什么都不向你呈现表达给你去看。
我第一次做这个的时候，什么都不懂。
一心想着快点拿到数据，好发文章。
结果呢？
两个月白干。
被导师看了我的结果之后, 导师叹气了, 导师说: “你所做的并非是在进行检测, 而是在搞谋杀。”。
那天晚上我在实验室待到凌晨三点。
对着显微镜发了半小时呆。
你知道吗，当你看多了死细胞，你会开始思考人生。
那些细胞为什么要死？
是程序性死亡，还是被你弄死的？
你永远不知道。
除非你做得足够好。
检测时间点到底怎么选
这是个大坑。
很多人觉得，加药后24小时，收细胞，检测。
理所当然。
狗屁。
不同药物，不同细胞，凋亡的时间点完全不一样。
我有个同学，做癌症药物的。
加药后12小时检测，什么信号都没有。
他以为药物没用。
结果48小时再看，细胞死得精光。
但已经晚了。
凋亡早期标志物早就过了。
他测出来的全是晚期和坏死的信号。
文章直接被拒了。
审稿人说：“你的数据缺乏早期凋亡证据。”
他来找我哭诉。
我能说什么呢？
只能告诉他，下次别这么莽。
最好做个时间梯度。
12小时、24小时、36小时、48小时。
每个时间点都收一管。
别怕麻烦。
科研的本质就是麻烦。
不麻烦的事，早就被别人做完了。
双染法的那些小秘密
Annexin V和PI，这两个老朋友。
大家都用。
但用得对不对，就两说了。
我曾遇见过一个人, 此人在添加 Annexin V 之后, 居然忘却了需把细胞放置于寒冰之上。
结果呢？
细胞在室温下疯狂内吞。
Annexin V全跑到细胞里面去了。
整个细胞都绿了。
他还在那纳闷，怎么我所有的细胞都是凋亡的？
我告诉他答案的时候，他脸都绿了。
比细胞还绿。
还有一个更离谱的。
PI染完以后，直接上机检测，没有加结合缓冲液。
PI浓度太大了。
活细胞都被染上了。
数据一塌糊涂。
所以呢，别觉得这些细节无所谓。
细节就是魔鬼。
你忽略它，它就弄死你。
操作手法比你想的重要
我不是吓你。
同样的试剂，同样的细胞，不同的人做。
结果能差三倍。
三倍啊！
一个人做的像教科书，一个人做的像垃圾场。
区别在哪？
操作手法。
洗细胞的时候，轻轻吹打。
别用那个大枪头猛戳。
你以为你在和面吗？
离心的时候，转速不要超过300g。
有些人心急，直接上500g。
细胞膜都被挤破了。
还有固定和透化。
做TUNEL检测的时候，固定液要用新鲜的。
别用那种在冰箱里放了三个月的多聚甲醛。
它会降解的。
降解了就没用了。
你省那几块钱，赔上的是整个实验。
值吗？
我觉得不值。
死细胞和活细胞，你真的分得清吗
这个问题，我问过很多人。
十个里面有八个，回答不上来。
他们觉得，只要细胞贴壁了，就是活的。
天真。
有些细胞，表面看着好好的，其实已经半死不活了。
线粒体膜电位都崩了。
只是还没完全裂开。
你检测的时候，它还能染上Annexin V吗？
能。
但它给出来的信号，是真实的早期凋亡信号吗？
不是。
是混淆信号。
就像一个人看起来在微笑，但内心已经崩溃了。
你问他“你还好吗”，他说“我没事”。
但你知道，他有事。
细胞也一样。
你需要用多种方法去验证。
不能只看一种。
流式做了，最好再看一下显微镜。
观察细胞形态。
有没有出泡？有没有皱缩？有没有形成凋亡小体？
肉眼能看到的，往往比机器更准。
我想说的最后一件事
做凋亡检测，就像谈恋爱。
急不得。
你不能一上去就表白。
你得先了解对方。了解它的喜好，它的脾气，它的弱点。
细胞也一样。
你得先了解它的生长特性，它的死亡机制。
然后才能设计实验。
每一步都要小心翼翼。
像在雷区跳舞。
错了，就重来。
别怕失败。
我失败的次数，多到我自己都数不清了。
但每次失败，我都学到一点东西。
现在呢，我基本不会翻车了。
不是说我不犯错。
而是我知道，哪里容易犯错，我会避开。
你也能做到。
只要你愿意慢下来。
去感受那些细胞。
去理解它们。
它们其实很讲道理的。
只要你尊重它们，它们就会给你想要的答案。
