实验室里，我盯着显微镜，心里骂了一句。
又做砸了。
细胞凋亡检测此物, 讲简易亦简易, 讲困难……哎呀, 着实困难。你耗费两日培育细胞, 谨小慎微添加药物予以处理, 然而染色完毕查看时, 发现细胞皆已漂浮, 或者根本未曾完全死亡, 数据全然无法使用。
这种感觉，懂的都懂。
实际上细胞凋亡检测, 确切的说就是欲明白细胞究竟死了没有, 是以何种方式死亡的。然而此“死”字别具大的学问、有的细胞走向自我毁灭, 有的细胞遭受他者致使死亡, 另有一些细胞看似已经死亡, 实则仅仅处于休眠状态。倘若你无法弄清楚这些情况, 后续所有的实验都将毫无成效、化为泡影。
因此, 今儿个咱就来谈谈这事儿。不搞那些像教科书般的冗长话语, 只讲讲在实际操作当中, 什么样的方法是切实靠得住的, 什么样的方法是容易掉入陷阱的。
凋亡细胞长什么样？
你先得知道，凋亡的细胞，看着就不一样。
常态下的细胞呈现出圆润饱满之貌, 乖乖地紧紧贴着壁。处于凋亡早期的细胞, 开始出现皱缩的状况, 恰似秋天那蔫了的叶子一般模样, 与此同时还会出现“泡”, 也就是细胞膜朝着外侧鼓出小小的包, 此被称为“出泡现象”。待到晚期时, 细胞径直裂变为一小块一小块的, 这被称作“凋亡小体”。
这玩意儿，用普通显微镜就能看个大概。
然则问题乃在于, 仅观其外形是不足够的呀。你必须要有数据, 必须要有图, 必须要使得审稿人不再言语, 所以, 还需要采用染色之方法。
膜联蛋白V/PI双染到底靠不靠谱？
这该是最为常用的方法了吧, 膜联蛋白V能够结合凋亡早期细胞膜上外翻的磷脂酰丝氨酸, PI仅仅可以进入死细胞, 两个进行组合, 活细胞、早期凋亡、晚期凋亡、坏死, 四个象限划分得明明白白。
觉着听起来挺容易的是, 然而当你运用的时候就会发觉, 哎, 怎么每一回都会出现那种PI以及膜联蛋白V均呈阳性的细胞, 这究竟是属于晚期凋亡呢还是坏死, 实在难以分辨。
我对这事琢磨了好长一段时间。之后老前辈跟我讲, 别再纠结了。有时细胞死亡太迅速, 早期阶段与晚期阶段仅仅相差那么几分钟, 在你进行检测的时候它们恰好处于中间状态。流式图上那一堆呈现双阳性的情况, 把它们当作“死亡细胞”看待, 反而会更加简便省事。
另有一坑, 即胰酶消化 , 消化时长久矣 , 细胞膜竟被其损伤 , 膜联蛋白V阳性率急剧攀升 , 新手于此极易受挫。
细胞里头的那些“自杀工具”
倘若你将细胞比拟为一个人, 那么凋亡即细胞所动工启动起来的自杀程序 , 此程序的关键要点在于一类称作是“半胱天冬酶”的蛋白。
caspase-3是其中一个“行刑者”。
对它的活性予以检测，所要查看的便是细胞究竟有没有真正开启凋亡程序, 方法并不复杂, 往里面添加一种荧光底物, 经caspase-3进行切割后, 荧光便会显现出来, 荧光是否明亮, 意味着杀伤数量的多少。
然而, 这同样存在着问题, 并非所有的凋亡都是依靠caspase - 3来实现的。对于某些非经典的凋亡途径而言吧, caspase - 3根本就不会发挥任何作用。要是你仅仅只是执着于关注它的话, 那么有可能会错过相当多的情况。
那么, 在进行检测以前, 最好心里应当有个底: 你所处理的那种药, 究竟会走哪一条路径。
DNA ladder是个老古董但挺实在
以前没流式细胞仪的时候，大家就靠这个。
在凋亡细胞当中, 其内部的DNA会被切割成为具有特定长度的片段, 接着进行琼脂糖凝胶电泳操作, 随后便能够看到呈现为阶梯模样的条带。而坏死细胞的DNA呈现为一团糊状, 并不会形成阶梯状。
此方法具备的益处为——价格低廉, 具备直观性品质。其存在的弊端是——显得过于粗糙, 在早期凋亡现象方面根本无法清晰辨别出来。并且, 你需要进行提取DNA的操作, 所涉及的步骤数量众多, 稍有疏忽就会出现降解的情况。
如今从事这个的人变少了, 然而倘若你在论文里能够附上一张美观的DNA ladder图, 那么审稿人反倒会认为你所做的实验扎实。
TUNEL法，又爱又恨
TUNEL法具备标记断裂的DNA末端的能力, 从理论层面来讲, 它能够精准地确定凋亡细胞的位置。
但实际上呢？
那些死掉的细胞同样会出现DNA断裂的情况。TUNEL这种方法根本没办法区分清楚究竟是细胞凋亡还是坏死。并且, 其操作的步骤数量简直多得离谱, 只要稍微一不小心就会使得背景高到让人惊恐的程度。我曾经见到过有人去做TUNEL, 最终阳性率竟然飙升到了90%, 而究其结果却是固定液所导致的问题。
因此, 要是你打算运用TUNEL, 那务必得设定好对照组, 阴性对照组须保障, 阳性对照组也不可缺, 不加酶的对照组同样也得有, 一个都不能欠缺, 不然你用一周时间拍得来的图, 根本没有胆量用于使用。
流式细胞术，一把双刃剑
流式细胞仪是做凋亡检测的大杀器。速度快，数据多，还能分选。
但存在的问题在于, 流式所涉及的数据实在是太易于被“美化”了。设置门的操作要是进行得巧妙, 什么样的结果都能够呈现出来。有一些人为了让数据看起来美观, 将门向右拉动一下, 阳性率刹那间就从百分之十转变为百分之三十了。
做科研，别骗自己。
安设门前期, 务必要瞅单阳对照。假若拿不准, 那就实施一回补偿处理。关于流式的数据是否好看, 完全取决于先期准备能否完备妥当。
到底选哪个方法？
这个真没法一句话说死。
若你仅仅意在飞快瞧个大致情况, 那么对于膜联蛋白V以及PI进行双染, 借助流式仪去运作一番, 一小时就能得出结果了句号。
若你期望发布优质文章, 用以证实细胞属于正经凋亡, 那么, 至少要采用两种方法彼此进行验证。比如说, 采用膜联蛋白V加上caspase - 3活性检测的方式, 或者再增添一个DNA ladder的检测方法。
单一的检测方法，审稿人根本不信。
此外, 细胞类型不一样, 检测的窗口期就存在差异。悬浮细胞凋亡速度快, 贴壁细胞凋亡速度慢。你所做的那个具体时间点, 或许恰好错过了凋亡高峰。因而, 进行时间梯度设置是很关键的——加药往后6小时、12小时、24小时, 分别收取一批细胞样本, 用来做对比。千万别只选取一个时间点去做, 那样就如同碰运气一般毫无准确性可言。
最后说点心里话
做细胞凋亡检测，最难的不是技术，是耐心。
有个方法要是做不出来, 别急着去换它。先去思考一下, 是不是操作方面出现了问题, 试剂有没有过期，细胞状态好不好。好多时候, 问题不是出在方法自身, 而是在你自己的那些细节上面。
我曾碰到这样一个师弟, 其进行膜联蛋白V/PI的操作, 持续两个月都未能顺利完成, 随后经查找发现, 原来是离心时速度设置得过高, 致使细胞全部破碎了。而后将转速从1500调整降低至1000, 相关数据瞬间就变得正确无误了。
所以，别急。
慢慢来，反而快。
结束检测之后, 要将原始数据妥善保存起来, 不要进行删除操作。因为你根本无法知晓, 具体在何时, 审稿人会提出需要你提供原始流式图的要求。一旦到了那个时候, 倘若找不到原始流式图, 那么后悔到哭泣都已经来不及了。
行了，就说这么多。希望你能一次做出漂亮的凋亡图。
